炭素・窒素循環を担う昆虫共生細菌系の因果構造~カブトムシ幼虫の共生細菌群と森林の腐植連鎖物質循環の推察~

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2022-05-18 理化学研究所

理化学研究所(理研)環境資源科学研究センター環境代謝分析研究チームの菊地淳チームリーダー、黒谷篤之特別研究員、生命医科学研究センター粘膜システム研究チームの宮本浩邦客員主管研究員、大野博司チームリーダーらの共同研究グループは、木材からなる木質バイオマスを食べる昆虫の複雑な共生細菌系において、炭素と窒素の循環を担う細菌が単一の優占細菌[1]だけではなく、共生細菌群のグループとして重要である可能性を計算科学により予測しました。

本研究成果は、昆虫と共生する細菌群(腸内共生細菌群)の多様性の意義を示すとともに、森林の腐植連鎖[2]を担う細菌群の炭素・窒素の代謝フロー[3]に関わる自然界の規則性の一つを理解する上で新たな視点を提供するものであり、持続可能な開発目標(SDGs)[4]の達成に貢献すると期待できます。

今回、共同研究グループは計算科学を活用して、森林生態系の腐植連鎖を担うカブトムシ幼虫を対象として、炭素と窒素の循環に関わる共生細菌群のプロファイリングを実施しました。その結果、循環型社会に役立つことが期待される優占共生細菌候補群が、増減変化の少ない他の共生細菌群とともに因果構造(因果関係の連鎖)を持つことが分かり、炭素・窒素の代謝フローを担う共生細菌群をグループに分類することが可能になりました。

本研究は、科学雑誌『Science of the Total Environment』オンライン版(5月1日付)に掲載されました。

木材残渣を食べる昆虫モデルの炭素・窒素の代謝フローのプロファイリング

背景

2000年以上前にアリストテレスは、「全体は部分の総和に勝る」という名言を遺しました。現在の自然環境に鑑みると、まさに「全体は部分の総和以上に」との考え方をしなければならない状況にあります。そこで、部分的な研究に慣れている生命科学では、研究を進める上で部分と全体の垣根を越えるためのツールが必要とされています。

また、人類が直面している問題に対する「持続可能な開発目標(SDGs)」の提言につながった「プラネタリー・バウンダリー[5](人類生存の安全な活動領域と限界点の定義)」では、特に生物多様性の減少と、窒素やリンによる湖沼や沿岸の富栄養化に警鐘を鳴らしています。富栄養化の主な要因は、大気中から固定化された窒素肥料が沿岸から流出することです。そのため、森林・農地から沿岸に至る生物圏における共生の仕組みの理解と、その理解に基づいた幅広い視点に立った環境保全の方策が持続可能な未来社会に向けて重要です。

菊地淳チームリーダーらは、これまでに木材を食べるシロアリの腸内の共生微生物代謝に着目し、空気中の窒素固定反応[6]とともに、森林生態系では炭素源の多い木材からなる木質バイオマスが昆虫のタンパク質源となり、生態系を豊かにする能力があることを明らかにしています注)。これらを踏まえ、本研究ではデータ集積と計算科学的アプローチとを組み合わせることで、カブトムシ幼虫をモデルとした昆虫の腸内共生細菌群における炭素・窒素の代謝フローに関する新しい規則性の探索を進めました。

注)2014年7月9日プレスリリース「シロアリの後腸に共生バクテリアによる新たな代謝経路を発見

研究手法と成果

共同研究グループは、森林から採取したカブトムシの幼虫を対象にした昆虫モデル系を作製しました。カブトムシ幼虫の腸内共生細菌群(以下、共生細菌群)の種類と密度を探るために、餌およびすみかとなる昆虫培養用の木材残渣と排泄糞を16SrRNAシーケンス解析[7]しました。

その結果、植物の成長促進に寄与する窒素固定菌(糞由来優占菌の例:Paenibacillus属、Bradyrhizobium属、Cohnella属など)、温暖化ガスである一酸化二窒素[8]の発生抑制に関わるアナモックス[9]菌(糞由来優占菌の例:Gemmatimonadetes門、Plactomycetes門など)、温暖化ガスであるメタンの産生菌(非優占菌の例:Methanobacterium属)、腸内の生体防御などに関わる酪酸[10]の産生菌(非優占菌の例:Coprococcus属)、天然の抗生物質を産生する菌(糞由来優占菌の例:Corallococcus属)、環境浄化に寄与するリグニン[11]分解菌(非優占菌の例:Sphingobium属)など、既報で示されているさまざまな機能性候補細菌群が検出されました。

また、木材残渣と排泄糞中の全炭素量と全窒素量、炭素の天然安定同位体比(δ13C)、窒素の天然安定同位体比(δ15N)の挙動を調べた上で、相関解析および膨大なデータから関係性の高い因子を見つけ出すアソシエーション解析を実施したところ、排泄糞中の優占菌(窒素固定菌、アナモックス菌)と非優占菌(メタン産生菌、酪酸産生菌、抗生物質産生菌、リグニン分解菌)に関係性があることが予測されました(図1)。

木材残渣を食べる昆虫モデル系の炭素・窒素の代謝フローのプロファイリングの図

図1 木材残渣を食べる昆虫モデル系の炭素・窒素の代謝フローのプロファイリング

a)本研究の全体像。カブトムシ幼虫を対象とした昆虫モデル系における木材残渣と排泄糞を調べる。
b-c)アソシエーション解析による炭素・窒素代謝フローに関わる共生細菌群の選抜。cは各機能性候補細菌と炭素・窒素との関係性を可視化している。


そこで、これらの共生細菌群を対象として「構造方程式モデリング[12]」によって重回帰モデル[12]を計算し、構成因子間の関係性を統計的に評価したところ、安定同位体炭素、安定同位体窒素、全炭素、全窒素の代謝に強く関与する最適な共生細菌群のグループにそれぞれ分類することができました(図2a)。

次に、三つの「統計的因果推論(実験データから統計的に因果関係を推定する手法)」によって、構造方程式モデル内の構成因子間の空間的因果関係を統計的に解析しました(図2b)。まず、構造方程式モデリングは最尤法[12]を採用しているため、異なる基準である準ベイズ近似[13]およびノンパラメトリック[14]による信頼区間を仮定した「因果媒介分析(因果関係における間接的効果に関する統計処理)」を実施した結果(本研究ではブートストラップ[15]1,000回)、共生細菌群グループ内の単一細菌との間接的因果関係は認められませんでした。このことから、構造方程式モデリングによって複数の計算指標の最適値を有した共生細菌群グループは、構成因子である単一の優占細菌ではなく、モデルグループ全体として重要であることが推察されました。

次に、「ベイズ的因果構造推定法[16]」によって構成因子間の因果関係の確率を計算したところ、因果媒介分析と同様に優占的な単一細菌による因果傾向は確認されず、共生細菌群グループ内の統計的な因果構造(因果関係の連鎖)のゆらぎ[17]が確認されました。これは、微生物生態系が恒常的に変動している可能性を意味しています。さらに「線形非ガウス非巡回モデル[18]」による因果関係の推察でも、単一の優占細菌ではなく、共生細菌群グループとしての関係性が示唆されました。これらの結果により、木質由来とそれ以外の炭素・窒素の代謝フローに関わる共生細菌群グループ候補の分類と可視化に成功しました。

また「物質収支フローモデル(サンキー・ダイアグラム[19])」によって、炭素・窒素の代謝フローの収支と構成因子の細菌群の関係性を可視化したところ、優占的な単一細菌に依存しない共生細菌群グループ内の機能的・構成因子的ゆらぎが存在する可能性が示されました。

以上のことから、炭素と窒素の循環を担う共生細菌群が単一細菌だけでなく、共生細菌群グループとして重要である可能性が計算科学により予測されました。そして、循環型社会に役立つことが期待される優占共生細菌候補群が、増減変化の少ない他の共生細菌群とともに因果構造(因果関係の連鎖)を持っており、炭素・窒素の代謝フローを担う共生細菌群をグループに分類することが可能になりました。

これらの成果は、昆虫と共生する微生物群の理解にとどまらず、自然環境における共生微生物群のグループとしての多様性と機能性を理解するための足掛かりとして有用な視点を提供しています。

昆虫共生菌群の因果構造の推察スキームと将来への展望の図

図2 昆虫共生菌群の因果構造の推察スキームと将来への展望

構造方程式による炭素・窒素の代謝フローの共生細菌グループ候補の分類、因果推論、ならびに可視化モデルの活用。

今後の期待

昆虫は世界で最も豊富な種を持つ生物であり、既知の全ての動物種の50%以上を占めていますが、その生物多様性は脅かされています。昆虫は生態系でさまざまな役割を果たしていますが、本研究の昆虫モデル系においても、化学肥料の削減に貢献しうる窒素固定菌、温暖化抑制に貢献しうるアナモックス菌や環境浄化に関与しうるリグニン分解菌の候補など持続可能な社会に役立つ細菌群が共生していることが示されました。昆虫との共生細菌系は、炭素・窒素の代謝フローにおいて複雑なネットワークを形成していますが、一方で、本研究により一定の共生細菌群グループが別々に代謝を担っているという規則性を持つ可能性が示されました。

これらの視点は、細菌以外の糸状菌、原虫などとの共生系を考慮した場合にはさらに複雑になる可能性がありますが、一方で、細菌群の数や種類の変化が、共生生物の個体群や機能的な変化を間接的に表現している可能性も推察されます。いずれにしても、本研究における計算生物学的手法は自然の規則性を紐解き、幅広い生物の共生系を考慮した研究を進めていく上でも、重要な視点を与える成果であると考えられます。

また、本成果は有望な単一の微生物を活用する従来型の微生物活用技術の限界の一端を示している可能性があり、今後、昆虫研究に限らず、生物共生に関わる基礎研究と産業応用の双方においても有用なヒントを提供するものと期待できます。実学的には、産業利用において、間伐材の処理は森を守ることにつながることから、昆虫や昆虫由来の共生細菌群を利用することで間伐材の分解効率が向上するといった昆虫利用の意義が本研究から明らかになりました。これは、今後の木質バイオマスの有効利用という観点における研究の発展の一助となることが期待できます。

環境代謝分析研究チームでは、土壌、底泥や水環境、さらには哺乳類や魚類の腸内環境を含むエコシステムのデジタル可視化「エコインフォマティクス[20]」を進めてきました。また、粘膜システム研究チームでは、主に哺乳動物を対象として、腸内共生システム[21]に関する世界的な研究成果を上げています。自然循環の中で、「腸」と「自然環境」は巨視的に見ればつながっていることから、本研究結果を踏まえて、さらなる研究の発展が期待できます。

例えば、森林・農地から沿岸に至る生物圏の多様性に対する理解が深まり、その可視化による理解に基づき、プラネタリー・バウンダリーの現状危機を回避するための判断指標を増やすことにつながる可能性があります。そして、冒頭で引用した「全体は部分の総和に勝る」、つまり着目する生態系全体を捉える手法を整備することで、持続可能な未来社会に向けた社会変革(デジタルトランスフォーメーション(DX))[22]を促進し、社会貢献につながる可能性もあります(図3)。

本研究成果は、国際連合が2016年に定めたSDGsの17項目のうち「14.海の豊さを守ろう」と「15.陸の豊かさを守ろう」に大きく貢献するものです。

将来の持続可能な社会構築の実現に向けた本研究の視点の活用事例の図

図3 将来の持続可能な社会構築の実現に向けた本研究の視点の活用事例

環境・生態複雑系は還元主義的アプローチではなく、全体論的アプローチで捉える必要がある。特に因果推論から生態系の恒常的ゆらぎを逸脱し重要因子となる予測マーカーを絞りこむことで、健全(≒恒常的)な環境・生態系維持に貢献し得る。

補足説明

1.優占細菌
任意の細菌群集を構成する細菌の中で、比較的数の多い細菌群の総称。

2.森林の腐植連鎖
森林生態系では、リグノセルロースのような難分解性バイオマスを分解・代謝できる細菌や担子菌類が、炭素・窒素などの資源循環に深く関わっている。

3.炭素・窒素の代謝フロー
微生物が炭素ならびに窒素を分解し、利用する巨視的な流れ。

4.持続可能な開発目標(SDGs)
2015年9月の国連サミットで採択された、持続可能でよりよい世界を目指す国際目標。17のゴールおよび169のターゲットで構成されており、国連加盟193か国が、2016年から2030年の15年間でこれらを達成することを目標としている。

5.プラネタリー・バウンダリー
Johan Rockstrome博士らによって2009年に提唱された、人類が生存できる安全な活動領域とその限界点を定義する概念。地球の限界、惑星限界とも呼ばれる。気候変動、生物多様性の喪失、生物地球化学的循環など、安全域や程度を示す限界値を有する9項目を定めている。

6.窒素固定反応
空気中に存在する豊富な窒素を反応性の高い窒素化合物に変換する反応。

7.16SrRNAシーケンス解析
生物の系統分類に使われる16SrRNA遺伝子の配列を解読し、データベース上の既知の細菌の配列と比較することで、試料中に存在する細菌を調べる解析手法。

8.一酸化二窒素
強力な温室効果を持つ気体の一つ。温暖化係数は二酸化炭素の約300倍あり、大気中の寿命が100年以上と長い。カビ由来のシトクロームP450norの脱窒酵素の反応過程で発生しやすいことが知られている。土壌からの発生量が最も多く、次に化学肥料の施肥量が多い農地や海洋、森林破壊によって発生する傾向がある。

9.アナモックス
嫌気的アンモニア酸化(anaerobic ammonium oxidation)の略。有機物を使わずに、アンモニアと亜硝酸から直接、窒素ガスを生成する細菌による反応であり、温暖化ガスである一酸化二窒素の発生に対して抑制的に働く。本研究成果から、昆虫の幼虫由来のアナモックス菌の存在も示唆された。温暖化ガスの発生源として最も多い土壌由来の温暖化ガスの発生を抑制する上で、昆虫の幼虫の排泄糞由来の共生細菌が豊富に存在しうる腐葉土などが環境保全に果たす役割についても、再考の余地があることが想定される。

10.酪酸
腸内細菌が作る重要な短鎖脂肪酸の一つ。腸管の保護や免疫系において制御性T細胞を誘導する。

11.リグニン
高等植物の木化に関与する高分子のフェノール性化合物。難分解性である。

12.構造方程式モデリング、重回帰モデル、最尤法
構造方程式モデリングは、複数の構成因子間の関係性を統計的に評価する手法の一つ。共分散構造分析とも呼ばれる。本研究では最尤(さいゆう)法(実験データから得られた母集団に基づく一般的な確率分布を推定する方法)を採用。重回帰モデルとは、例えばy=ax+bの関係(回帰)が二つ以上存在するモデルのことを指す。

13.準ベイズ近似
複数の仮説から確率が最終的に最大になる仮説を選択する推定方法をベイズ推定という。準ベイズ近似はベイズ推定の活用で、サンプルの統計的性質から経験的確率を利用して、未知のデータ分布を算出する方法である。

14.ノンパラメトリック
データが平均値付近に集積する正規分布(ガウス分布)には従っていない、特定の確率分布に依存しないデータを使用する方法。

15.ブートストラップ
一つの標本から繰り返して大量の標本を生成し、それらの標本から推定値を計算して、母集団の性質を推定する手法全般。

16.ベイズ的因果構造推定法
ベイズ推定を活用して、因果関係を持つ特定のグループ内の有向グラフ全体の確率を解析する統計手法。

17.ゆらぎ
統計的平均からのずれ。巨視的には一定であっても、微視的には平均値前後で絶えず変動している現象。

18.線形非ガウス非巡回モデル
非ガウス分布を形成する独立因子に対して、因果関係を推察する統計処理のこと。

19.サンキー・ダイアグラム
任意のプロセス内の物質の流れを可視化する図表の一つ。1898年の蒸気機関のエネルギー効率に関する書物で示されており、著者の名前に因んで名付けられている。

20.エコインフォマティクス
生態学・環境科学と情報科学を統合した学問体系を示す。なお、環境代謝分析研究チームでは、核磁気共鳴法などを用いて、環境・生態系全体の複雑系を網羅的に解析評価し、データサイエンスを駆使して、土壌や水圏などの環境微生物叢の統合評価を進め、荒漠地土壌の改良法の構築、有機農法の作用機序の解明、ならびに日本各地の海水中無機物、有機物、物理因子の統合解析から、海洋環境の生態系の破綻(赤潮発生など)の可視化技術の開発などを進め、生態系のデジタル可視化を進めてきている。

21.腸内共生システム
生物の腸内微生物叢が、微生物間や微生物-生体間でさまざまな共生反応を示すシステムの全体を示す概念。菊地チームリーダーらは、昆虫の腸内共生システムにおいて、シロアリを対象として窒素循環モデルの評価系などを構築している。また、大野チームリーダーらとともに、腸内細菌由来の酢酸が病原性大腸菌に対する腸管保護に深く関与していることを証明した。また、大野チームリーダーらは、腸内の免疫担当細胞の一つであるM細胞の表面マーカーを世界に先駆けて報告するとともに、中枢神経系の疾患、肥満、生体防御に関わる腸内微生物叢の制御機構に関して報告している。

22.デジタルトランスフォーメーション(DX)
デジタル技術の普及によって、人間のあらゆる生活が根底から変化するという概念。各種データ蓄積やクレンジングをおこなうDigitization、整備されたデータからの特徴抽出や将来予測を行うDigitalizationを経て、実社会への変革が起こるDigital transformationへと3段階が必要とされる。

共同研究グループ

理化学研究所
環境資源科学研究センター 環境代謝分析研究チーム
チームリーダー 菊地 淳(キクチ・ジュン)
専任研究員 守屋 繁春(モリヤ・シゲハル)
特別研究員 黒谷 篤之(クロタニ・アツシ)
研究員 嶋 秀明(シマ・ヒデアキ)
生命医科学研究センター
粘膜システム研究チーム
チームリーダー 大野 博司(オオノ・ヒロシ)
客員主管研究員 宮本 浩邦(ミヤモト・ヒロクニ)
(千葉大学大学院園芸学研究院 連携客員教授、株式会社サーマス、日環科学株式会社)
研究員 加藤 完(カトウ・タモツ)
マイクロバイオーム研究チーム
副チームリーダー 須田 亙(スダ・ワタル)
客員主管研究員 服部 正平(ハットリ・マサヒラ)

千葉大学 大学院園芸学研究院
教授 児玉 浩明(コダマ・ヒロアキ)
博士課程2年 浅野 風斗(アサノ・フウト)

栃木県那須郡那珂川町立馬頭中学校
1年生 石澤 孝太郎(イシザワ・コウタロウ)

株式会社サーマス
副主任研究員 松浦 真紀子(マツウラ・マキコ)
研究員 石井 千歳(イシイ・チトセ)
研究員 辻 直子(ツジ・ナオコ)
研究員 中熊 映乃(ナカクマ・テルノ)
(日環科学株式会社)

原論文情報

Hirokuni Miyamoto, Futo Asano, Koutarou Ishizawa, Wataru Suda, Hisashi Miyamoto, Naoko Tsuji, Makiko Matsuura, Arisa Tsuboi, Chitose Ishii, Teruno Nakaguma, Chie Shindo, Tamotsu Kato, Atsushi Kurotani, Hideaki Shima, Shigeharu Moriya, Masahira Hattori, Hiroaki Kodama, Hiroshi Ohno, Jun Kikuchi, “A potential network structure of symbiotic bacteria involved in carbon and nitrogen metabolism of wood-utilizing insect larvae.”, Science of the Total Environment, 10.1016/j.scitotenv.2022.155520

発表者

理化学研究所
環境資源科学研究センター 環境代謝分析研究チーム
特別研究員 黒谷 篤之(クロタニ・アツシ)
チームリーダー 菊地 淳(キクチ・ジュン)
生命医科学研究センター 粘膜システム研究チーム
客員主管研究員 宮本 浩邦(ミヤモト・ヒロクニ)
チームリーダー 大野 博司(オオノ・ヒロシ)

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当

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