ヒトES細胞由来網膜の移植後機能を確認

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重度免疫不全末期網膜変性マウスを作製し移植後光反応を検証

2018年3月2日  理化学研究所,実験動物中央研究所,大日本住友製薬,日本医療研究開発機構

要旨

理化学研究所(理研)多細胞システム形成研究センター網膜再生医療開発プロジェクトの万代道子副プロジェクトリーダー、実験動物中央研究所(実中研)動物資源基盤技術センターの高橋利一センター長、大日本住友製薬再生・細胞医薬神戸センターの岸野晶祥センター長らの共同研究グループは、ヒトES細胞(胚性幹細胞)[1]由来の網膜組織を重度免疫不全マウス[2]の末期網膜変性[3]モデルに移植して、形だけでなく機能的にも成熟することを確認しました。

ヒトのES細胞/iPS細胞(人工多能性幹細胞)[1]から効率よく立体の網膜細胞が分化誘導されることが報告され注1、2)、その臨床応用が期待されています。万代副プロジェクトリーダーらはこれまでに、マウスのES細胞/iPS細胞由来の網膜組織を視細胞[4]が変性・消退し、光を感じない末期のマウス網膜変性モデルに移植すると、生着後成熟し移植先の神経細胞と機能的につながり、光が分かるようになることを報告しています注3、4)。また、ヒトES細胞由来の網膜組織についても、免疫不全ラットやサルの視細胞変性モデルに移植後成熟することを形態・組織学的に示しました注5)。しかし、臨床応用にあたってヒトのES細胞やiPS細胞由来の移植片が光に応答するかの検証が残っていました。ヒトの移植視細胞の機能検証では、移植によるモデルの残存機能に対する保護効果と区別する必要があるため、特に視細胞の残存機能がほとんどない末期モデルを用いる必要があります。しかし、変性の激しいマウスやラットなどの末期網膜変性モデルではヒトの網膜組織は成熟しにくいという問題がありました。

今回、共同研究グループは、拒絶反応を全く示さない重度免疫不全マウスの末期網膜変性モデル(NOG-rd1マウス)の作製に成功し、移植後の機能検証を可能にしました。実際に、ヒトES細胞由来の網膜組織をNOG-rd1マウスに移植したところ、半年後には成熟した視細胞の生着、電子顕微鏡観察による外節構造[5]の形成、視細胞が光を感じるために必要な視物質[6]の存在を確認できました。さらに、移植先の網膜を摘出し多電極アレイシステム[7]を用いて調べたところ、光に対する反応、つまり機能的な成熟も確認できました。

本研究成果は、ヒトES細胞から分化誘導した網膜組織が臨床応用に使える可能性を示しています。今後、ヒトへの移植での検証が待たれます。

本研究は、米国の科学雑誌『Stem Cell Reports』(3月13日号)に掲載に先立ち、オンライン版(3月1日付け:日本時間3月2日)に掲載されます。

本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)再生医療実現拠点ネットワークプログラム疾患・組織別実用化研究拠点(拠点A)「視機能再生のための複合組織形成技術開発および臨床応用推進拠点」の支援を受けて実施しました。

注1)2012年6月14日プレスリリース「ヒトES細胞から立体網膜の形成に世界で初めて成功」
注2)2015年2月19日プレスリリース「ヒトES細胞から毛様体縁を含む立体網膜を形成」
注3)2014年4月25日CDBニュース「ES・iPS細胞由来の網膜組織をマウスに移植」
注4)2017年1月11日プレスリリース「iPS細胞由来の網膜組織を用いた視機能の回復」
注5)2015年12月25日CDBニュース「ヒトES細胞由来網膜組織を疾患モデルサルに移植」

※共同研究グループ
理化学研究所
多細胞システム形成研究センター
網膜再生医療研究開発プロジェクト
副プロジェクトリーダー 万代 道子(まんだい みちこ)
(科学技術ハブ推進本部 創薬・医療技術基盤プログラム プロジェクトリーダー)
プロジェクトリーダー 高橋 政代(たかはし まさよ)
副プロジェクトリーダー 杉田 直(すぎた すなお)
研修生 伊良波 諭(いらは さとし)
研究員 ホンヤ・ツ(Hung-Ya Tu)
研究員 山崎 優(やまさき すぐる)(大日本住友製薬 研究員)
研究員 砂川 玄志郎(すながわ げんしろう)
研究員 松山 武(まつやま たけし)
研究員 小出 直史(こいで なおし)
研修生 渡邊 健人(わたなべ たけひと)
テクニカルスタッフ(研究当時) 藤井 桃(ふじい もも)
立体組織形成研究チーム
チームリーダー 永樂 元次(えいらく もとつぐ)
ライフサイエンス技術基盤研究センター 超微形態研究チーム
チームリーダー 米村 重信(よねむら しげのぶ)
実験動物中央研究所
動物資源基盤技術センター
センター長 高橋 利一(たかはし りいち)
資源開発室
室長代理 後藤 元人(ごとう もとひと)
研究員 香川 貴洋(かがわ たかひろ)
大日本住友製薬 再生・細胞医薬神戸センター
センター長 岸野 晶祥 (きしの あきよし)
主任研究員 桑原 篤(くわはら あつし)
熊本大学 眼科学
教授 谷原 秀信(たにはら ひでのぶ)
背景

網膜色素変性は遺伝的な原因より、桿体(かんたい)細胞[4]という網膜の周辺部に分布する視細胞が変性・消退していく疾患で、中心に分布する錐体細胞[4]も2次的に変性し、徐々に視覚が失われていきます。原因遺伝子が分かっている場合、早期であれば変性を防ぐ治療が期待されますが、末期のものに対しては現在のところ有効な治療法はありません。

ヒトのES細胞(胚性幹細胞)/iPS細胞(人工多能性幹細胞)から効率よく高純度の立体の網膜組織が分化誘導できることが報告されて以来、その移植による臨床応用への期待が高まっています。以前、マウスの視細胞の形態は残存しているが機能しないモデルにおいて、視細胞をバラバラにして移植すると生着して機能が回復するという報告がありました。最近になって、これらの移植後の機能回復は、移植視細胞から移植先の視細胞への細胞内の物質移動による効果であることが報告されました。そのため、本来、網膜でのシグナル伝達でみられるような視細胞と双極細胞[8]との間のシナプス[9]結合(シグナル伝達機構)が移植視細胞と移植先の双極細胞の間でも起こるかについての検証は、移植先の視細胞がほとんど失われた末期のモデルで行う必要があると考えられるようになりました。

万代副プロジェクトリーダーらはこれまでに、視細胞とともに視機能の失われたマウス末期網膜変性モデルに、マウスのiPS細胞から分化誘導した胎児期相当の幼若な網膜組織を移植すると、移植後視細胞が層構造を形成しつつ形態的に綺麗に成熟すること、これらの成熟移植片が光に反応してそのシグナルを移植先に伝えるとともに、一部のマウスでは光が分かるようになることを行動検査で示しました。さらに、ヒトES細胞由来の網膜組織でも、免疫不全ラットやサルの視細胞変性モデルを用いて、これらの組織が移植後形態的に成熟し、成熟を示すタンパク質などを発現していることを形態・組織学的に示しました。しかし、臨床応用にあたって、ヒトES細胞由来の網膜組織がマウスのES/iPS由来網膜組織と同じように光に反応するかという検証がまだ行われていませんでした。

ただし、このような機能検証は常に、“移植先に残存している視細胞や視機能の応答に対する移植細胞の保護効果”と“移植細胞そのものの応答”との区別が問題となります。また、これまでマウスiPS細胞由来の網膜組織の移植後の機能検証に用いていた残存機能がほぼ失われた非常に変性の速いマウスでは、免疫抑制剤を用いてもヒトES細胞由来の網膜組織が移植後に綺麗に成熟しないという問題があり、ヒトの組織が機能的に生着する免疫不全マウスのモデルを確立する必要がありました。

そこで今回は、まず残存機能がほぼ失われた免疫不全の末期の網膜変性モデルマウスを作製・評価し、その後にヒトES由来網膜組織の移植後の生着、成熟、機能評価を試みました。

研究手法と成果

第一ステップとして共同研究グループは、実験動物中央研究所においてrd1-2J(rd1)、rd10というよく用いられる2種類のマウス末期網膜変性モデルをそれぞれ重度免疫不全マウス(NOGマウス)と掛け合わせて、ヒト網膜組織の機能を評価するための2種類の重度免疫不全の末期網膜変性マウス「NOG-rd1」と「NOG-rd10」を作製しました(図1)。


図1 重度免疫不全化した2種類のマウス末期網膜変性モデルの作製

rd1-2Jおよびrd10網膜色素変性マウスを重度免疫不全マウス(NOGマウス)とそれぞれ掛け合わせることにより、2種類の重度免疫不全網膜変性マウスを作製した。aはrd1-2J、bはrd10の生後8週齢の眼底断層像(上)と網膜電位検査の結果(下)。a、bそれぞれ左図はNOGマウスの変性ヘテロ動物(rd1-2J/+とrd10/+)右は変性ホモ動物(rd1-2J/rd1-2Jとrd10/ rd10)。a、bどちらもホモ動物で視細胞層(ONL)が消失し網膜電位検査では光応答が消失している。スケールバーは200μm。

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