2023-04-06 東京大学
中川 綾哉(生物科学専攻 博士課程)
平野 央人(生物科学専攻 特任助教)
大村 紗登士(生物科学専攻 修士課程)
濡木 理(生物科学専攻 教授)
発表のポイント
- CRISPR-Cas酵素の祖先として注目されるTnpBの立体構造を決定した。
- TnpBが自身のゲノムにコードされる長鎖ノンコーディングRNAと協働して標的DNAを切断する分子機構を明らかにした。
- TnpBからCRISPR-Cas酵素への進化の過程を明らかにした。
発表概要
東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻の中川綾哉大学院生、平野央人特任助教、大村紗登士大学院生、濡木理教授らは、クライオ電子顕微鏡(注1)を用いて、CRISPR-Cas酵素(注2)の祖先として注目されるトランスポゾン(注3)関連タンパク質TnpBの立体構造を決定しました。得られた立体構造から、TnpBが自身のゲノムの末端にコードされる長鎖ノンコーディングRNA(注4)(ωRNA)と複合体を形成し、標的DNAを切断する機構を明らかにしました。さらに、生化学的な解析および、これまでに報告されているCRISPR-Cas酵素の立体構造との比較から、TnpBからCRISPR-Cas酵素への進化の過程を明らかにしました。
本研究成果は、2023年4月6日に英国科学誌「Nature」に掲載されました。
発表内容
原核生物のCRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するCas9やCas12は、ガイドRNAと協働して2本鎖DNAを特異的に切断するRNA依存性DNAエンドヌクレアーゼです。Cas9やCas12は、ゲノム上の狙った位置でDNAを切断できることから、「プログラム可能な」ゲノム編集ツールとして、遺伝子治療などへの応用が進んでいます。これまでの研究から、多様なサブタイプが報告されているCas12酵素は、IS200/IS605トランスポゾンスーパーファミリーにコードされているTnpBから進化してきたと考えられてきました。TnpBの機能については長い間分かっていませんでしたが、近年の研究から、自身のトランスポゾンの末端から転写されるlong non-coding RNA(ωRNA)と協働してDNAを切断するRNA依存性DNAエンドヌクレアーゼであることが明らかとなりました。しかし、Cas12酵素と比較して非常に小さいTnpBがどのようにωRNAと協働して標的DNAを切断するのか、またTnpBからCas12酵素がどのように進化してきたのかについてはよく分かっていませんでした。
今回、東京大学の濡木理教授らのグループは、Deinococcus radiodurans ISDra2由来のTnpBに着目し、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析を行いました。得られた構造から、ωRNAが塩基配列からは予測できない複雑な構造をとることで、TnpBタンパク質と複合体を形成していることが分かりました(図1)。
図1:TnpB–ωRNA–標的DNA複合体の立体構造
TnpBはWEDドメイン、RECドメインから構成されるREC lobe、およびRuvCドメイン、TNBドメインから構成されるNUC lobeの二葉構造をとり、自身がコードされるトランスポゾン配列の末端から転写されるωRNAと複合体を形成していた。ωRNAに含まれるガイド配列–標的DNA二本鎖はREC lobeとNUC lobeの間の溝に結合していた。
また、構造解析および生化学的な解析から、TnpBは12塩基程度の短い塩基配列を認識して標的DNAを切断することが明らかになり、TnpBは自身がコードされるトランスポゾン配列の複製に関与するだけでなく、新たな位置に転移させる可能性が示唆されました。さらに、これまでに報告されているさまざまなCas12酵素の構造との比較から、CRISPR-Cas12酵素は二量体化、もしくは新たなドメイン(REC2)の挿入というまったく異なる2つの戦略によって、より長いDNA配列を認識する能力を獲得するように進化してきたことが分かりました(図2)。この能力により、CRISPR-Cas獲得免疫機構として機能するために必要な標的特異性を得られるようになったと考えられます。本成果は、CRISPR-Cas獲得免疫機構のさらなる理解に貢献するだけでなく、革新的な新規ゲノム編集技術の開発に繋がると期待されます。
図2:TnpBからCas12酵素への進化
TnpBとCas12酵素の中でもTnpBと配列相同性の高いCas12酵素の立体構造比較から、Cas12酵素は二量体化、もしくはREC2の挿入によって、TnpBよりも長い標的DNAを認識していることが明らかとなった。
論文情報
- 雑誌名
Nature論文タイトル
Cryo-EM structure of the transposon-associated TnpB enzyme著者
Ryoya Nakagawa, Hisato Hirano, Satoshi N. Omura, Suchita Nety, Soumya Kannan, Han Altae-Tran, Xiao Yao, Yuriko Sakaguchi, Takayuki Ohira, Wen Y. Wu, Hiroshi Nakayama, Yutaro Shuto, Tatsuki Tanaka, Fumiya K. Sano, Tsukasa Kusakizako, Yoshiaki Kise, Yuzuru Itoh, Naoshi Dohmae, John van der Oost, Tsutomu Suzuki, Feng Zhang, and Osamu Nureki
研究助成
本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED) 先端的バイオ創薬等基盤技術開発事業「安全な遺伝子治療を目指した万能塩基編集ツールの創出」(研究代表者:濡木 理)官民研究開発投資拡大プログラム(PRISM)「ゲノム編集酵素の機能モジュールデータ基盤構築」(課題番号:JPJ008000 研究分担者:濡木 理)、AMED「創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業」の一環とした「創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム(BINDS)」、AMED 「ワクチン開発のための世界トップレベル研究開発拠点の形成事業」の一環とした「ワクチン開発のための世界トップレベル研究開発拠点群 東京フラッグシップキャンパス」などの支援により行われました。
用語解説
注1 クライオ電子顕微鏡
液体窒素(-196℃)冷却下でタンパク質などの分子に対して電子線を照射し、試料の観察を行うための装置。タンパク質や核酸の立体構造の決定に利用されている。↑
注2 CRISPR-Cas酵素
原核生物のもつCRISPR-Cas獲得免疫システムにおいて外来核酸の分解を担う酵素。CRISPR-Cas酵素は6つのタイプ(I–VI型)に分類される。II型CRISPR-Cas酵素Cas9やV型CRISPR-Cas酵素Cas12はgRNAと複合体を形成し、gRNAと相補的な2本鎖DNAを特異的に切断する。↑
注3 トランスポゾン
ゲノム上を動く遺伝子。トランスポゾンの転移は遺伝情報の破壊につながる可能性をもつ。↑
注4 長鎖ノンコーディングRNA
タンパク質に翻訳されない長いRNAのこと。
