染色体の形は細胞分化と共にこう変わる~分化に伴うゲノムの三次元構造変化を1細胞レベルで明らかに

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2019-08-13 理化学研究所

理化学研究所(理研)生命機能科学研究センター発生エピジェネティクス研究チームの三浦尚研究員、平谷伊智朗チームリーダーらの共同研究チームは、マウスES細胞[1]の分化[2]に伴う染色体の時間的・空間的な構造変化が、トポロジカルドメイン(TAD)[3]と呼ばれる約1Mb(メガベース=100万塩基対[4])のDNAの塊を単位とする核内配置変化であることを、1細胞レベルで突き止めました。

本研究成果は、哺乳類染色体の三次元構造の構築原理に迫るものであり、染色体の構造変化と遺伝子発現[5]制御の統合的な理解にもつながると期待できます。

哺乳類細胞では、染色体の1本1本は、TADが数珠つながりになった形で核内に収納されています。核内での染色体の形や位置は細胞種によって異なり、細胞分化の際には染色体構造が変化すると考えられますが、TADのようなMbレベルの階層でどのように変化するかは、全く分かっていませんでした。

今回、共同研究チームは、マウスES細胞の分化に伴う染色体の三次元構造変化を調べ、これがTADを単位とする核内配置の変化であることを1細胞レベルで突き止めました。この核内配置の変化は染色体上のさまざまな領域で生じ、その領域の遺伝子発現の活性化とよく対応し、しかも核内配置変化が遺伝子発現の活性化よりも先に起きることも分かりました。このことから、染色体の三次元構造変化を調べることで、将来の遺伝子発現変化を予測できる可能性が示唆されました。

本研究は、英国の科学雑誌『Nature Genetics』の掲載に先立ち、オンライン版(8月12日付け:日本時間8月13日)に掲載されます。

細胞分化に伴う哺乳類染色体の三次元構造変化の図

図 細胞分化に伴う哺乳類染色体の三次元構造変化

※共同研究チーム

理化学研究所 生命機能科学研究センター 発生エピジェネティクス研究チーム

チームリーダー 平谷 伊智朗(ひらたに いちろう)

研究員 三浦 尚(みうら ひさし)

基礎科学特別研究員 高橋 沙央里(たかはし さおり)

研究員 ラウィン・プーンパーム(Rawin Poonperm)

テクニカルスタッフⅠ 谷川 明恵(たにがわ あきえ)

三重大学大学院 生物資源学研究科 生命機能化学講座 分子細胞生物学分野

准教授 竹林 慎一郎(たけばやし しんいちろう)

※研究支援

本研究は、日本学術振興会(JSPS)科学研究費補助金若手研究「1細胞DNA複製タイミング解析による発生分化過程の核内コンパートメント動態予測(研究代表者:高橋沙央里)」、同新学術領域研究(研究領域提案型)「染色体機能ドメインの可塑性とその意義(研究代表者:竹林慎一郎)」、同新学術領域研究(研究領域提案型)「細胞分化にともなうクロマチンポテンシャルの変化とその分子基盤(研究分担者:平谷伊智朗)」、科学技術振興機構(JST)戦略的創造研究推進事業個人型研究(さきがけ)の研究領域「エピジェネティクスの制御と生命機能(研究総括:向井常博)」の研究課題「三胚葉分化直前の条件的ヘテロクロマチン形成の発生生物学的意義(研究者:平谷伊智朗)」による支援を受けて行われました。

背景

生命の設計図であるゲノムDNA[6]は、マウスでは40本、ヒトでは46本のDNA分子に分かれて細胞核内に存在しています。各々のDNA分子は数千万~数億塩基対の長さを持ち、タンパク質との複合体(クロマチン[7])を形成して、細胞核内で高度に折り畳まれて各々の染色体を形作っています。なお、かつては「染色体」は細胞周期[8]の分裂期[8]に現れる明瞭な構造体に付けられた用語でしたが、現在では、一般的に間期[8]の時期も含めたクロマチン構造のことを指します。本研究で言及する「染色体の形」とは、間期の染色体のことです。

染色体の構造には階層があります。最も小さい階層には、DNA分子の基本単位であるヌクレオチド[9](1塩基)や、クロマチンの基本単位であるヌクレオソーム[10](約146塩基対のDNAと8個のヒストンタンパク質)といった構造が存在します(図1)。より大きな階層になると、約1Mb(メガベース=100万塩基対)長のDNAが球状に折り畳まれた「トポロジカルドメイン(TAD)」と呼ばれる構造があり、複数のTADがさらに数珠つながりになって空間的にまとまった配置をとることが分かっています(図1)。この配置はTAD内に存在する遺伝子の発現と密接な関わりがあるとされ、遺伝子がよく転写[5]されているTADが集まったものをAコンパートメント[11]、転写されていないTADが集まったものをBコンパートメント[11]と呼んでいます(図1)。各階層の特徴的な構造が積み重なって形作られた染色体という巨大な三次元構造が、遺伝子の発現や細胞の分化とどのような関係にあるのかを解明することは、真核細胞の機能を理解する上で重要なテーマの一つです。

近年、Hi-C法[12]などゲノム全体にわたってクロマチンの核内構造を解析する手法の開発が進んだ結果、同一の生物種であればTADとその境界の位置は細胞種によらず一定であるのに対し、A/Bコンパートメント[11]の分布は細胞種に特異的であると考えられるようになりました。これが正しければ、細胞種が変わるとき、すなわち細胞分化の際には、Aコンパートメントに含まれていたTADがBコンパートメントに変わるといった変化が生じるはずです。しかし、これを詳しく調べた報告はなく、その実態は全く分かっていませんでした。

そこで、共同研究チームは、Hi-C法を用いてマウスES細胞の分化に伴う染色体の三次元構造変化の詳細な全ゲノム解析[13]を行いました。特に、核内コンパートメント[11]の分布変化という観点から詳しく解析を行い、これと遺伝子発現やDNA複製[14]といったゲノム機能の変化との関係を調べました。さらに、Hi-C法は細胞集団を対象とした解析手法であるため、得られた知見が1細胞レベルでも成り立つかについて、最近独自に開発した1細胞全ゲノム解析法であるscRepli-seq法[15]も取り入れて研究を進めました注1)

注1)2019年2月26日プレスリリース「ゲノムDNA複製の真の姿を捉えた

研究手法と成果

細胞分化に伴う染色体の三次元構造変化を1細胞レベルで経時的に追跡するには、培養下の細胞を均一に分化できる実験系が必要です。先行研究により、核内コンパートメントに大きな変化が見られる時期として、マウスの胚発生初期に起きるエピブラスト[16]の分化の時期が考えられました注2)。そこで、この時期の細胞分化過程を試験管内で再現するため、まずマウスES細胞を2日間かけてエピブラスト様細胞(EpiLC)[17]に分化させました。そして、このEpiLCにSFEBq法(無血清凝集浮遊培養法)[18]という方法論を適用することで、7日間でマウスES細胞をエピブラスト様の状態を経て、均一に神経前駆細胞へ分化誘導させる実験系の構築に成功しました(図2)。

この実験系を用いて、マウスES細胞分化過程において経時的にHi-C解析を行ったところ、分化前はAコンパートメントであった領域が、分化後にはBコンパートメントに変化(あるいはその逆)する様子が、ゲノム上のさまざまな領域で認められました(図3)。核内コンパートメントの分布はDNA複製タイミング[14](ゲノムDNA複製の際、どの領域から順に複製が進行するかという順序)とよく相関し、Aコンパートメントは細胞周期のS期[8]前半に複製される領域と、BコンパートメントはS期後半に複製される領域とそれぞれ一致する傾向を示すことが知られています。今回の実験系で再現した細胞分化の過程でも、核内コンパートメントとDNA複製タイミングは予想通り高い相関を示し、さらに、A/Bコンパートメントが入れ換わる領域と複製タイミングが変化する領域はゲノム上で重複しており、両者が協調的に変化していることが分かりました(図3、A/Bコンパートメントの赤と緑の色分けと、DNA複製タイミングの青と緑の色分けを比較)。また、核内コンパートメントが変化するゲノム領域は、複製タイミングに加えて、核内配置、特に核ラミナ[19](核内膜タンパク質)との距離が変化することも確認できました(図3、核ラミナ結合)。このことから、Hi-Cで観察される核内コンパートメント変化が、核内空間における染色体の物理的な動きであることが強く示唆されました。

このように、核内コンパートメント変化は、ゲノムのさまざまな形質の変化を伴います。AコンパートメントとBコンパートメントは、それぞれ遺伝子がよく転写されている領域と転写が抑えられている領域に対応しており、これらの変化のうち何が原因で何が結果であるかを明らかにするのは重要です。その糸口をつかむため、核内コンパートメント、複製タイミング、遺伝子発現の三者の変化の時間的な関係を調べたところ、特にBコンパートメントからAコンパートメントへの変化が、S期後半から前半への複製タイミング変化と遺伝子発現の活性化に先立って起きている例が多く観察されました(図4)。すなわち、三者の中では核内コンパートメントの変化が最も時間的に先行しており、これがその後に起きる複製タイミング変化や遺伝子発現の上昇を引き起こしている可能性が考えられました。

では、7日間にわたるES細胞分化の過程で、核内コンパートメントはいつどのように変化していくのでしょうか。これを調べるために、細胞集団のHi-C解析に加えて、1細胞ごとのDNA複製プロファイルを、最近独自に開発したscRepli-seq法を用いて全ゲノム解析しました。その結果、細胞集団中にはS期前半から後半を含むさまざまな細胞周期の細胞が存在し(図5a)、それらのDNA複製プロファイルは同じ培養日数の細胞集団を見るとグラフ上の一つの曲線(経路)で近似され、かつ培養0日から培養7日にかけて一定の傾向で変化していくことが認められました(図5b)。この結果から、個々の細胞においても、複製タイミングの変化に先行して起きる核内コンパートメント分布の変化が、細胞集団中で徐々に、しかし一様に起きている可能性が示されました(図5b)。また、核内コンパートメント分布と複製タイミングプロファイルは、分化後5日目に一過的にエピブラスト幹細胞(EpiSC)[20]に非常に近くなり、ES細胞が分化の過程でEpiSCに極めて近い状態を経て神経分化したと解釈できました(図5b、「5日」と「EpiSC」のグラフを比較)。

さらに、ゲノムDNA上でどのような領域が核内コンパートメント変化に関わっているかを調べるため、分化前後での細胞集団のHi-C解析データを詳細に比較しました。その結果、A/Bコンパートメントが入れ換わる現象は、コンパートメント内部に新しいコンパートメントが現れるのではなく、ほとんどの場合においてAコンパートメントとBコンパートメントの境界が移動することによって生じていることが分かりました(図6a、b)。 これらのコンパートメント境界は、ほぼ全てがTADとTADの間に存在しており、TADの構造を崩すような位置にコンパートメント境界が移動することはなく、変化の大半は約1Mb長のTAD一つ分の変化であることが分かりました(図6c)。また、体細胞からiPS細胞[21]へのリプログラミング[22]の過程についても同様の解析を行ったところ、やはりTAD一つ分を単位とする核内コンパートメント変化が観察されました(図6c)。最後に、細胞集団を対象としたHi-C解析でコンパートメント変化を示したTADについて、scRepli-seq解析を行ったところ、TADを単位とする複製タイミング変化が1細胞レベルでも多く観察できました(図6d)。

以上の結果を総合すると、細胞分化に伴うコンパートメント変化の実態は、AコンパートメントとBコンパートメントの境界に接しているTAD一つ分の核内配置変化であるといえます(図7)。コンパートメント変化は染色体上のさまざまな場所で起きており、これに引き続いて起きる複製タイミング変化や遺伝子発現変化の引き金となっている可能性も考えられます。また、TADは細胞集団を用いたHi-C実験で得られた概念であるため、個々の細胞にTADが存在するか否かはいまだに議論が分かれています。本研究結果は、TADを単位とする制御が1細胞レベルで確かに起きていることを示しており、個々の細胞におけるTADの存在を支持するものといえます(図7)。

注2)Takahashi, S., Kobayashi, S. & Hiratani, I. Epigenetic differences between naïve and primed pluripotent stem cells. Cell. Mol. Life Sci. 75, 1191–1203 (2018).

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