仔マウスのシグナルを受け取ると雌マウスは雄の求愛を拒否する

幼少フェロモンＥＳＰ２２の脳神経受容機構を解明

幼少フェロモンＥＳＰ２２の脳神経受容機構を解明

2018-10-26 東京大学 ,科学技術振興機構

ポイント

雌マウスは、仔マウスの涙液中に含まれるフェロモンＥＳＰ２２（Ｅｘｏｃｒｉｎｅｇｌａｎｄ－ＳｅｃｒｅｔｉｎｇＰｅｐｔｉｄｅ２２）を受容すると、雄のマウント行動（求愛）を拒否する（雌マウスの性行動が抑制される）ことが明らかになりました。
ＥＳＰ２２は生後２～３週令において時期特異的に仔マウスの涙液中に発現する幼少フェロモンで、その受容体は、フェロモンを受容する鋤鼻（じょび）神経細胞に発現するＶ２Ｒｐ４（Ｖｍｎ２ｒ１１５）であることがわかりました。また、ＥＳＰ２２がＶ２Ｒｐ４に受容されてから雌マウスの性行動を抑制するまでに働く、一連の神経回路機構を明らかにしました。
これまでにＥＳＰ２２が雄マウスの性行動を抑制することが知られていましたが、本研究で雌マウスの性行動の抑制にも働くことがわかりました。ＥＳＰ２２によって雌雄の成熟マウスの性行動が抑制されることは、仔マウスにとって、自らが十分に成長するまでの間、親マウスからの十分な養育を受け、安全かつ競争の少ない生息環境を維持するために有益であると考えられます。

マウスなどのげっ歯類において、性行動や攻撃行動といったさまざまな社会行動は、フェロモンなど化学感覚シグナルによって制御されています。タンパク性のフェロモンは、マウスの涙液中や尿に存在します。例えば、雄マウスの涙液中に含まれるＥＳＰ１は、雌マウスの性行動を促進します。また、雄マウスの尿中に含まれるＭＵＰ３（ＭａｊｏｒＵｒｉｎａｒｙＰｅｐｔｉｄｅ３）は、雄マウスの攻撃行動を促進する働きを持ちます。フェロモンの中には、発現に性差が存在するものや、発現の時期に特異性があるものも存在します。その中の１つにＥＳＰ１と同じペプチドファミリーに属するＥＳＰ２２^注１）があります。ＥＳＰ２２は生後２～３週令の仔マウスの涙液中において発現がピークとなり、性成熟後は発現が見られなくなります。
ＥＳＰ２２は周囲の雄マウスの性行動を抑制する働きを持つことが知られています。しかしＥＳＰ２２が、フェロモン受容器である鋤鼻器官（Ｖｏｍｅｒｏｎａｓａｌｏｒｇａｎ，ＶＮＯ）^注２）にあるどの受容体によって感知されるのか、また、ＥＳＰ２２が雌マウスに対してどのような働きがあるかについてはわかっていませんでした。東京大学大学院農学生命科学研究科／ＪＳＴＥＲＡＴＯ東原化学感覚シグナルプロジェクトの東原和成　教授らの研究グループは、ＥＳＰ２２が鋤鼻器官に発現している単一の受容体Ｖ２Ｒｐ４（Ｖｍｎ２ｒ１１５）によって受容されること、また、ＥＳＰ２２が雄マウスだけでなく雌マウスの性行動も抑制し、その結果雌マウスの妊娠が遅れることを明らかにしました。さらに、その行動には脳内の分界条床核（ＢＮＳＴ）から視床下部腹内側核の外腹側部（ＶＭＨｖｌ）に投射している抑制性の神経細胞が関わっていることを解明しました。この成果は、性行動を制御する神経回路機構についての理解を深めるだけでなく、倉庫や都市部で問題となっているマウスの過繁殖や、それに伴う被害を抑制するための一助となる可能性があります。
本研究成果は、２０１８年１０月２６日（米国東部時間）に「ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」のオンライン版で公開されます。

＜発表内容＞

生物はライフサイクルの中で、出産後の親の養育行動、テリトリーや個体間の順位を決定づける攻撃行動など、さまざまな社会行動を営みます。マウスなどのげっ歯類において、さまざまな社会行動は、同種の他個体が分泌するフェロモンによって制御されていることが知られています。本研究では、仔マウスが涙液中に分泌するフェロモンＥＳＰ２２に着目し、その受容から雌マウスにおける行動出力までの一連の流れを明らかにしました。
マウスの尿や涙液中に含まれるペプチドの中には、フェロモンとして機能する分子が存在します。雄マウスの涙液中に含まれるＥＳＰ１もその１つです。ＥＳＰ１は雄マウスの攻撃行動を促進し、雌マウスの性行動を促進します（Ｈａｇａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１０，Ｈａｔｔｏｒｉｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ２０１６）。ＥＳＰペプチドファミリーに含まれる他のフェロモンとして、ＥＳＰ２２があります。ＥＳＰ２２は生後２～３週令に発現のピークが存在し、性成熟後はその発現は見られません。ＥＳＰ２２については、雄マウスの性行動を抑制することが明らかにされています（Ｆｅｒｒｅｒｏｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１３）。しかし、ＥＳＰ２２の受容体や雌マウスに対する機能はこれまでに解明されていませんでした。本研究では、雌マウスにおける幼少フェロモンＥＳＰ２２の脳神経受容機構とそのフェロモンによって引き起こされる行動出力を明らかにすることを目指しました。
まず、ＥＳＰ２２の雌マウスに対する働きを明らかにするため、さまざまな行動実験を行いました。その結果、ＥＳＰ２２をあらかじめ与えて嗅がせた雌マウスでは、雄マウスが交尾のためのマウント行動を仕掛けた際に、立ち上がったり、体をひねることで拒否する行動が、嗅がせていない雌マウスと比較して２～３倍多く観察されました（図１）。本研究グループはこれらの行動を拒否行動（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）と定義しました。また、ＥＳＰ２２を雌マウスに約１０日間連続して提示しながら雄マウスとの交配を行う実験を行いました。その結果、ＥＳＰ２２を提示した雌マウスでは、交配の開始から出産までに通常より２～３日長くかかる個体や、実験期間中に出産が観察されない個体がそれぞれ２～３倍多くなり、ＥＳＰ２２による性行動の抑制が交配の成功確率を低下させることで雌の妊娠ならびにその後の出産を遅らせることがわかりました。
次にＥＳＰ２２を受容する受容体の同定を試みました。鋤鼻器官には約１２０種類の鋤鼻２型受容体（Ｖ２Ｒ）が存在し、不揮発性分子の受容に関わっています。タンパク性のフェロモンであるＥＳＰ２２の受容体を絞り込むために、まずｄｏｕｂｌｅｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション^注３）を行い、受容体候補Ｖ２Ｒ遺伝子を３つに絞り込みました。その後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システム^注４）を利用して作製したノックアウトマウスを用いた実験を行い、単一の鋤鼻２型受容体Ｖ２Ｒｐ４（Ｖｍｎ２ｒ１１５）がＥＳＰ２２の機能的な受容体であることが明らかになりました。Ｖ２Ｒｐ４はすでに同定されていたＥＳＰ１の受容体Ｖ２Ｒｐ５ととても良く似た遺伝子配列を持つ受容体です。雌マウスの性行動を促進するＥＳＰ１と抑制するＥＳＰ２２が、Ｖ２Ｒｐ５とＶ２Ｒｐ４という相同性の高い受容体で受容されながらも、雌マウスの性行動に対して正反対の行動をもたらすことは興味深い知見です。
鋤鼻受容体で受容されたシグナルは、鋤鼻神経細胞がその軸索を伸ばしている副嗅球（ＡＯＢ）へ伝達され、その後は、扁桃体内側核（ＭｅＡ）や視床下部腹内側核（ＶＭＨ）といった高次脳領域へと伝達されます。本研究では、ＥＳＰ２２が雌マウスのＶ２Ｒｐ４で受容された後、どのような神経回路を介して性行動が抑制されるのかについて解析を行いました。初期応答遺伝子を指標にした活性化細胞のマッピング^注５）や、人工的に合成された受容体分子への作動薬によって神経活動を制御する薬理遺伝学ツール^注６）によって、ＥＳＰ２２が雌マウスの性行動を抑制する機構には、ＭｅＡや分界条床核（ＢＮＳＴ）に分布する神経細胞が関わっていることが明らかになりました。また、ウイルストレーサー^注７）や光遺伝学^注８）による解析によって、ＥＳＰ２２が雌マウスの性行動の抑制を引き起こす際には、ＢＮＳＴから視床下部腹内側核の外腹側部（ＶＭＨｖｌ）へと投射する抑制性の神経細胞の活性化が重要な役割を担っていることも示されました。本研究によってＥＳＰ２２は雌マウスにおいて、Ｖ２Ｒｐ４→ＡＯＢ→ＭｅＡ／ＢＮＳＴ→ＶＭＨｖｌという経路を介して性行動を抑制することが明らかになりました。
本研究グループにおける先行研究によって、ＥＳＰ１はＶ２Ｒｐ５→ＡＯＢ→ＭｅＡ→ＶＭＨｄ（視床下部腹内側核の背側部）という経路を介して雌マウスの性行動を促進することが明らかにされています（Ｉｓｈｉｉｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ２０１７）。これらの研究成果をあわせて考えると、ＥＳＰ２２とＥＳＰ１が相同性の高い鋤鼻受容体で受容されながらも、異なった神経回路によってその情報が伝達され、雌マウスの性行動に対して正反対の行動をもたらすということが明らかになりました（図２）。
仔マウスが分泌するフェロモンによって、周囲のマウスの性行動が抑制されることにはどのような生物学的意義があるのでしょうか。アカネズミなどの野生のマウスでは、主に雌マウスが縄張りを形成すること、また、雌マウスにおいて性行動が増加すると攻撃行動のモチベーションが上昇することも知られています。これらのことからＥＳＰ２２が周囲の雌マウスの性行動を抑制することで、母親以外の雌マウスによる自らや母親マウスへの攻撃行動を抑えている可能性が考えられます。また、ＥＳＰ２２が存在することで、周囲の繁殖を抑制し、仔マウスと生息空間や栄養を共有することになる同世代の個体の増加を抑制している可能性も示唆されます。その結果、仔マウスは自らが十分に成長するまでの間、安全な生息環境を維持しつつ、母マウスからの十分な養育を受けることができ、その後の生存につながる有益性を得ているものと考えられます。今後は、野生マウスを使った解析や、広い飼育フィールドを用いた解析を行うことによって、ＥＳＰ２２の自然環境下における意義が明らかにされることが期待されます。幼少フェロモンＥＳＰ２２が雄マウスだけでなく、雌マウスの性行動も抑制すること、また、その際の重要な神経回路基盤を明らかにした本研究の成果は、倉庫や都市部などで問題となっているマウスの過繁殖への対策につながる可能性があります。

＜参考図＞

図１　仔マウスの涙液中に含まれる幼少フェロモンＥＳＰ２２は雌マウスの性行動を抑制する

仔マウスが分泌する幼少フェロモンＥＳＰ２２を受容した雌マウスは、雄の求愛（マウント行動）を高い頻度で拒否するようになります。

図２　涙液中に含まれるタンパク性のフェロモンが雌マウスの性行動を制御する際の神経回路

幼少フェロモンＥＳＰ２２（青色）は受容体Ｖ２Ｒｐ４で受容され、雌マウスにおいてＡＯＢ→ＭｅＡ／ＢＮＳＴ→ＶＭＨｖｌという神経回路を介して、性行動を抑制させます。一方で、雄フェロモンＥＳＰ１（赤色）はＶ２Ｒｐ５で受容され、ＡＯＢ→ＭｅＡ→ＶＭＨｄという回路を介して、雌マウスの性行動を促進します（Ｉｓｈｉｉｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ２０１７）。本研究ならびに、本研究グループにおける先行研究によって、２つのタンパク性のフェロモンが相同性の高い受容体で認識されながらも、異なる神経回路を介して、雌マウスの性行動を正反対に制御していることが明らかになりました。

＜用語解説＞

注１）ＥＳＰ２２: マウスのゲノム上には３８種類のＥＳＰ（Ｅｘｏｃｒｉｎｅｇｌａｎｄ－ＳｅｃｒｅｔｉｎｇＰｅｐｔｉｄｅ）遺伝子が存在し、ペプチドファミリーを形成している。一方で、ヒトのゲノム上にはＥＳＰ遺伝子は存在していない（Ｋｉｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ２００７）。マウスのＥＳＰペプチドの中ではＥＳＰ１についてその解析が進んでおり、ＥＳＰ１はＶ２Ｒｐ５（Ｖｍｎ２ｒ１１６）を発現する鋤鼻神経細胞で受容され、雌マウスの性行動や雄マウスの攻撃行動を促進する機能を持つ。近年ではＥＳＰ２２についても解析されており、ＥＳＰ２２が生後２～３週令の幼少マウスの涙液中に時期のみに分泌され、雄マウスの性行動を抑制することが２０１３年に明らかにされた。
注２）鋤鼻器官: 鼻腔下部に存在する管状の感覚器であり、フェロモンをはじめとした化学シグナルの受容に関わる。両生類から哺乳類の多くの動物に存在するが、ヒトなどの高等霊長類においては機能していない。鋤鼻器官で受容されたシグナルの情報は、一次中枢である副嗅球を経由して、扁桃体内側核や視床下部腹内側核といった高次脳領域に伝達される。
注３）Ｄｏｕｂｌｅｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション: Ｄｏｕｂｌｅｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞に発現する特定のｍＲＮＡを認識するＲＮＡプローブを同時に複数利用することで異なるｍＲＮＡを同時に検出する手法である。本研究では、神経細胞の活性化の指標となる初期応答遺伝子Ｅｇｒ１を認識するＲＮＡプローブと各鋤鼻２型受容体を認識するＲＮＡプローブを利用した。それによって、ＥＳＰ２２によって活性化される鋤鼻神経細胞において発現している鋤鼻２型受容体を３種類に絞り込んだ。
注４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システム: ＣＲＩＳＰＲ（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）／Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ９）は本来、細菌や古細菌においてウイルスなどの侵入物を標的として、それらを排除するように機能する適応免疫機構である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用すると哺乳類をはじめとしたさまざまな生物種において、ゲノム中の任意の配列を切断できることが明らかにされた。現在では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いることで、さまざまな生物種において、簡便かつ従来の方法と比較すると短時間で、遺伝子ノックアウト個体を作製することが可能となっている。
注５）初期応答遺伝子を指標にした活性化細胞のマッピング: 初期応答遺伝子とは神経細胞の活性化に伴い、短時間で発現が見られる遺伝子のことである。神経科学分野においては、初期応答遺伝子の発現が神経細胞の活性化の指標として使われることが多い。本研究では、初期応答遺伝子の１つであるｃ－Ｆｏｓの発現を指標として用い、発現細胞を定量した。それによって、ＥＳＰ２２によって活性化されている神経細胞が多い脳領域の絞り込みを行った。
注６）薬理遺伝学ツール: 薬理遺伝学ツールＤＲＥＡＤＤ（ＤｅｓｉｇｎｅｒＲｅｃｅｐｔｏｒｓＥｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙＡｃｔｉｖａｔｅｄｂｙＤｅｓｉｇｎｅｒＤｒｕｇ）は人工的合成リガンドによって特異的に活性化されるように遺伝子変異を加えたＧタンパク質共役型受容体である。本研究では、ヒトＭ４ムスカリン性アセチルコリン受容体を元にして、生体内には存在しない化学物質ｃｌｏｚａｐｉｎｅ－Ｎ－ｏｘｉｄｅ（ＣＮＯ）によって活性化されるよう改変された人工受容体ｈＭ４Ｄｉを用いた。ｈＭ４Ｄｉを神経細胞に局在させると、ＣＮＯを受容した際にその神経細胞の活動を抑制することができる。
注７）ウイルストレーサー: 脳の中では、神経細胞同士がシナプスと呼ばれる構造を介して情報の伝達を行っている。また、１つの神経細胞の中には情報を受け取る部分と次の神経細胞などに情報を伝達する部分のそれぞれが存在する。すなわち、脳内における神経回路網には方向性が存在する。ウイルストレーサーはそのような性質を持った回路網を可視化する目的で多く利用されている。ウイルストレーサーには起点となる神経細胞に感染した後に、回路の下流へと移行する性質を持つもの（順行性トレーサー）と上流にさかのぼるように移行するもの（逆行性トレーサー）の両方が存在する。
注８）光遺伝学: 光遺伝学（オプトジェネティクス）は、光で活性化されるタンパク質を特定の細胞に導入し、その細胞の機能を光照射によって制御する手法のことである。本研究では、光感受性の非選択的な陽イオンチャネルであるＣｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ２（ＣｈＲ２）を用いた。ＣｈＲ２を発現する神経細胞に青色光を照射することで、特定の神経細胞の活性化を誘導することができる。

＜論文情報＞

タイトル:“Sexual rejection via a vomeronasal receptor-triggered limbic circuit”
著者:Takuya Osakada, Kentaro K. Ishii, Hiromi Mori, Ryo Eguchi, David M. Ferrero, Yoshihiro Yoshihara, Stephen D. Liberles, Kazunari Miyamichi and Kazushige Touhara
ＤＯＩ:10.1038/s41467-018-07003-5