患者数が急増している治療が難しい呼吸器感染症、肺MABC症の新しい鑑別方法と薬剤感受性検査法を発明

2021-01-12 国立感染症研究所,日本医療研究開発機構

このたび、国立感染症研究所ハンセン病研究センター感染制御部の星野仁彦室長、吉田光範主任研究官、阿戸学部長らは、株式会社カネカと共同開発で、近年急激な勢いで増加し、公衆衛生上重要な難治性感染症である肺Mycobacterium abscessus complex(MABC)症の3亜種、および治療の鍵となる抗生物質マクロライドに対する誘導耐性を簡便かつ短時間に検査する手法を開発したことを報告しました。本研究は、国立台湾大学、慶應義塾大学、複十字病院、結核研究所などと共同で行ったもので、2021年1月11日午後11時30分(英国標準時)、国際学術誌“EBioMedicine”に掲載されます。

ポイント

Mycobacterium abscessus complex(MABC)は3つの亜種があり、マクロライドに対する感受性が亜種間で異なり、患者治療成績が変わることが報告されています。
米国胸部学会や欧州呼吸器学会などの治療ガイドラインでは、患者より分離されたMABCに対して、マクロライド誘導耐性に対する感受性検査やシーケンス検査を行うことを推奨していますが、時間や手間がかかるものでした。
本研究グループは、株式会社カネカと共同でMABCの3亜種の鑑別とマクロライド誘導耐性の有無を簡便かつ短時間に行える方法を開発しました。
株式会社カネカは2021年度中の商品化を目指しています。また海外展開も検討中です。

背景

非結核性抗酸菌(NTM)症は、結核菌とらい菌以外の抗酸菌によって起きる病気です。結核とは異なり、ヒトからヒトへ感染はしませんが、一旦発症すると抗菌薬による治療が難しい点があげられます。国内では結核の減少とは逆に発症者が増えてきており、確実に有効な治療がないため、患者数は蓄積されてきています。全国疫学調査を実施した結果、2014年の肺NTM症の推定罹患率は14.7人/10万人年と算出され、2007年の調査と比較して約2.6倍に増加していることがわかり、公衆衛生上重要な感染症であることが示されました(※1)。特に難治例が多い肺Mycobacterium abscessus complex(MABC)(※2)症の推定罹患率は0.5人/10万人年と算出され、2007年調査と比較して5倍に増加していました。肺MABC症の院内死亡率は15%前後に達する例も報告されており、原因の一端は多様な抗菌薬に対して自然耐性を示すことにあります(※3)。

肺MABC症は、患者間の予後が違うことから、原因菌は均一でないことが以前より推測されていました。今日では、MABCには、ゲノムの相同性が96%以上の3つの亜種が存在し、鍵となる抗菌薬の一つであるマクロライド(※4)に対する感受性が亜種により異なることが知られており、予後が異なることの原因が、感染する亜種によるものであると考えられています。そのため治療開始時に、亜種を鑑別してマクロライドの反応性を予測することは重要であり、米国胸部学会、欧州呼吸器学会、欧州臨床微生物感染症学会、米国感染症学会の4学会が2020年に合同で発表した肺NTM症のガイドライン(※5)でも推奨されています。しかし、現在検査室で汎用されている質量分析法(TOF-MS法)などでは、この3亜種を正確に鑑別することができず、またマクロライドの反応性も14日間の薬剤感受性検査を行うか、または薬剤感受性遺伝子配列を調べなければならず、時間や手間、費用がかかる検査でした。

成果

今回本研究グループは日本で臨床分離された150株程度のMABCに対して、次世代シーケンサによるゲノム情報解析とマクロライド感受性試験を行い、MABC3亜種それぞれに特異的なゲノム配列部位を見出しました。また、マクロライドで長期間治療を続けてもマクロライド耐性を示さない(誘導耐性を示さない)遺伝子パターンを持つ菌株群、つまりマクロライドが治療効果を示す菌株群に特異的なゲノム配列部位を見出しました。これらのゲノム部位を遺伝的な目印(genetic marker)として検出することで、MABC3亜種とマクロライド治療奏功性の鑑別を予測できるようにしました。このgenetic markerの検出を株式会社カネカのDNAクロマトグラフィー法(図1)に応用し、サーマルサイクラー(※6)のみを使用して1時間程度でMABCの3亜種とマクロライドの誘導耐性(自然耐性)の有無を鑑別する方法を開発しました(図1)。また、本方法の有用性は、台湾で臨床分離したMABC100株程度をもちいて、実際の臨床検体でも確認されました。

図1　DNAクロマトグラフィーの原理株式会社カネカのDNAクロマトグラフィー法は、特殊プライマーを用いて合成されるPCR産物を、テストストリップにて検出する方法です。A.5’末端側に一本鎖DNAタグを有し、3’末端側に標的特異的に結合するプライマー領域を有する特殊プライマーを用います。タグとプライマーは修飾部位を介して連結されています。B.特殊プライマーを用いてPCRを行うと、修飾部位にて反応が停止するため、両末端に一本鎖DNAタグを有するPCR産物が得られます。C.タグ付加PCR産物をテストストリップに展開すると、図中の①～③のステップを経て、タグを介してPCR産物が標識・捕捉されテストストリップ上のライン着色として目視検出可能となります。特殊プライマーとタグのセットを変えることにより一度に複数のPCR産物を検出することも可能です。

MABCの亜種鑑別と薬剤感受性を調べる検査として欧米で一般的なラインプローブ法(※7)は必要とされる菌量も多く、特殊な機械を必要とし、さらに検査には数時間かかっていたのに対し、本方法はサーマルサイクラーを所有している病院の検査室においては、きわめて簡便かつ短時間に、MABCの3亜種の鑑別やマクロライド耐性(自然耐性、誘導耐性)を推測することができます(図2)。測定感度は10pgのDNA(培養菌2,000個由来)であり、本DNAクロマトグラフィー法とゲノム情報による鑑別結果の一致率は99.7%でした。また結核菌などの代表的な抗酸菌との交差反応は起きないことが確認されました。

図2　代表的なDNAクロマトグラフィーの結果T1とT2のラインで薬剤感受性を鑑別し、T3、T4、T5のラインでMABC3亜種の鑑別を行います。

今後の展望

株式会社カネカが2021年度中の実用化に向けて準備を進めております。実用化により、短時間にてMABCの亜種鑑別とガイドライン推奨のマクロライド感受性を推測できるようになります。

研究協力者

株式会社カネカ、国立台湾大学、慶應義塾大学、複十字病院、結核研究所

本研究への支援

本研究は国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)「新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業」の支援によって行われました。

発表論文

雑誌名: EBioMeidicine(※8)
論文タイトル: A Novel DNA Chromatography Method to Discriminate Mycobacterium abscessus Subspecies and Macrolide Susceptibility
著者名: 吉田光範、佐野創太郎、Jung-Yien Chien、深野華子、鈴木仁人、朝倉崇徳、森本耕三、村瀬吉朗、宮本重彦、倉島篤行、長谷川直樹、Po-Ren Hsueh、御手洗聡、阿戸学、星野仁彦
DOI番号: 10.1016/j.ebiom.2020.103187
公開時間: 2021年1月11日午後11時30分(英国標準時)

用語解説

(※1)呼吸器感染症を引き起こす肺非結核性抗酸菌症の国内患者数が7年前より2.6倍に増加―肺結核に匹敵する罹患率―(AMEDプレスリリース2016年6月7日)

(※2)Mycobacterium abscessus complexは非結核性抗酸菌の一種で、Mycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. bolletii、Mycobacterium abscessus subsp. massilienseの3亜種に分類されます。3亜種間のゲノムの相同性は96%以上ですが、マクロライドに対する感受性が異なり、患者間の予後には大きな違いがあることが報告されています。

(※3)薬剤の耐性機序には大きく分類して内因性の自然耐性と後天性の獲得耐性があります。自然耐性には、抗酸菌の名前の由来でもある細胞壁の化学的特性などの他に、耐性遺伝子が誘導されて生じる誘導耐性があります。M. abscessusやM. bolletiiの多くの菌株は培養5日目ではマクロライド感受性ですが、培養14日までには耐性遺伝子が誘導されてマクロライド耐性となります。実際の患者さんに対する治療期間は一年以上であることが多いので、その場合は長い治療期間を経てマクロライド耐性(誘導耐性)となっていきます。一方、一部のM. abscessusや殆どのM.massilienseは耐性遺伝子が働かず、誘導耐性が生じないためマクロライド感受性となります。これに対して後天的な獲得耐性は遺伝子の変異によって後から生じるので、本検査では検出することはできません、獲得耐性は遺伝子変異をシーケンス法で検出する必要があります。

(※4)マクロライドは肺NTM症の治療において鍵となる抗菌薬で、クラリスロマイシンやアジスロマイシンなどが含まれます。MABC症ではマクロライドの効果がある患者と効果がない患者がいることが以前より指摘されており、MABC亜種の相違によりマクロライドに対する感受性が異なることが明らかにされています。

(※5)Daley CL, Iaccarino JM, Lange C, Cambau E, Wallace RJ, Andrejak C, Böttger EC, Brozek J, Griffith DE, Guglielmetti L, Huitt GA, Knight SL, Leitman P, Marras TK, Olivier KN, Santin M, Stout JE, Tortoli E, van Ingen J, Wagner D, Winthrop KL
Treatment of Nontuberculous Mycobacterial Pulmonary Disease: An Official ATS/ERS/ ESCMID/IDSA Clinical Practice Guideline.
Clin Infect Dis. 2020 Aug 14;71(4):905-913. doi: 10.1093/cid/ciaa1125.
Eur Respir J. 2020 Jul 7;56(1):2000535. doi: 10.1183/13993003.00535-2020.

(※6)サーマルサークラ―は、ポリメラーゼ連鎖反応によりDNA断片を複製させるための機器のひとつ。本検査ではPCR反応をこの機器で行います。

(※7)ラインプローブ法はPCRで増幅した核酸断片を、DNAプローブにハイブリダイズさせ検出する方法です。検出までに、一本鎖化処理、ハイブリダイズ、複数回の洗浄、発色など多段階の工程を要し、時間、手間、費用がかかる検査であるため、検査室の日常業務では行うことができません。一方、DNAクロマトグラフィー法は、タグが付加された増幅断片がストリップ上を流れる過程で、着色粒子による標識とテストストリップ上での捕捉によるライン着色が同時に起こるため、洗浄等の煩雑な操作を必要とせず、極めて短時間で増幅断片を検出することができます。

(※8)EBioMedicineは、Cell PressとThe Lancetによってサポートされている査読システムを経て掲載されるオープンアクセス医学雑誌で、Elsevier社より出版されています。