天然化合物の生産を増強する小分子~二次代謝物生産を増強するβカルボリン作用機構の解明~

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2020-09-11 理化学研究所

理化学研究所(理研)環境資源科学研究センター天然物生合成研究ユニットの高橋俊二ユニットリーダー、ケミカルバイオロジー研究グループの長田裕之グループディレクターらの共同研究グループは、放線菌[1]の二次代謝産物[2]である「リベロマイシンA(RM-A)[3]」生産が、「β-カルボリン[4]誘導体」の添加によりLuxRファミリー[5]転写因子[6]を介して増強されるメカニズムを見いだしました。

本研究成果は、類似の転写因子に制御される遺伝子群を活用した新しい天然化合物の創出につながると期待できます。

放線菌は、医薬・農薬などに用いられる有用生理活性化合物の宝庫として知られています。これまでのゲノム解析によって、30以上の二次代謝生合成遺伝子クラスターが発見されていますが、その多くは休眠遺伝子クラスターです。二次代謝生合成遺伝子クラスターの活性化機構を解明することは、創薬シーズとなり得る新しい天然化合物を創出する上で重要です。

共同研究グループはこれまでに、β-カルボリン誘導体(BR-1)を添加して放線菌Streptomyces sp. SN-593を培養すると、RM-A生産が増強されることを報告しています。今回、BR-1がLuxRファミリー転写因子(RevU)に結合することによって、revU遺伝子上流のプロモーター[7]領域への結合を促進し、RM-A生合成遺伝子クラスター全体の発現を増強することを明らかにしました。さらに、BR-1は、異種の放線菌二次代謝物の生産も増強することを発見しました。

本成果は、オンライン科学雑誌『Scientific Reports』(6月23日付)に掲載されました。

推定されるLuxRファミリー転写因子(RevU)の発現増強機構の図

推定されるLuxRファミリー転写因子(RevU)の発現増強機構

背景

放線菌は、医薬品、農薬、抗生物質など、構造多様性を持つ有用な二次代謝産物を生産することが知られています。微生物二次代謝物の生産誘導機構を解明し、放線菌ゲノム中に存在する生合成遺伝子クラスターを活性化する手法を開発することは、新たな天然化合物の創出や、有用化合物の高生産において重要といえます。また、微生物二次代謝物は、土壌中の生物間相互作用やケミカルシグナルに応答して生産されると考えられています。化合物による二次代謝産物の生産誘導機構を解明することは、自然界の微生物応答の理解にもつながると期待されます。

放線菌Streptomyces sp. SN-593は、「リベロマイシンA(RM-A)」を生産します。これまでに共同研究グループは、理研NPDepo化合物ライブラリー[8]を用いてスクリーニングを行い、RM-A生産を増強する化合物を特定しました。また、構造活性相関研究によって、低濃度でRM-A生産を増強する「β-カルボリン誘導体(BR-1)」の作製にも成功しています(図1)注1)

本研究では、BR-1が二次代謝物の生産を増強するメカニズムの解明を試みました。

BR-1添加による放線菌二次代謝物RM-Aの生産増強の図

図1 BR-1添加による放線菌二次代謝物RM-Aの生産増強

放線菌Streptomyces sp. SN-593にβ-カルボリン誘導体(BR-1)を低濃度で添加すると、リベロマイシンA(RM-A)生産が増強される。

注1)Panthee S, Takahashi S, et.al. β-carboline biomediators induce reveromycin production in Streptomyces sp. SN-593 Sci. Rep. volume 9, Article number: 5802 (2019)

研究手法と成果

共同研究グループはまず、Streptomyces sp. SN-593のゲノム解読情報をもとに、BR-1存在下と非存在下で全RNA発現解析を行いました。その結果、21個の遺伝子から構成されるRM-A生合成遺伝子クラスターの発現が有意に増加し、LuxRファミリー転写因子(RevU)をコードするrevU遺伝子発現の増加も確認できました(図2)。また、RM-A生産性を失ったrevU遺伝子破壊株では、BR-1存在下でも生産性を回復できないことが分かりました。

次に、BR-1とRevUの相互作用を調べるため、放線菌内で転写因子RevUを発現させ、粗抽出液を調製した後、BR-1結合ビーズと混合しました。電気泳動により結合タンパク質分離し、得られた単一のバンドをMALDI-TOF/MS分析[9]したところ、標的はRevUであることが判明しました。

BR-1によるRM-A生合成遺伝子クラスターの発現増強の図

図2 BR-1によるRM-A生合成遺伝子クラスターの発現増強

a)RM-A生合成遺伝子クラスター。全長は91キロ塩基で、revA~revUの21個の遺伝子から構成される。

b)BR-1添加後に誘導されるRM-A生合成遺伝子。LuxRファミリー転写因子(RevU)の遺伝子発現が上昇していることが確認できた。破線はBR-1を添加しないときの発現量。

続いて、revU遺伝子のプロモーター領域へのRevU結合がBR-1によって強化されるかどうかを調べるために、表面プラズモン共鳴(SPR)[10]分析を行いました。ビオチン標識された二本鎖DNA断片をストレプトアビジンというタンパク質でセンサーチップに固定化し、SPRを用いてRevUプロモーター結合活性を評価しました。その結果、濃度1.25マイクロモーラー(μM、1μMは100万分の1モーラー)のBR-1の存在によって、結合活性が増強することが分かりました(図3a)。また、RevUはrevU遺伝子上流に存在するCTG-(N10)-CAG配列を含む遺伝子断片に、濃度依存的に結合することも分かりました。BR-1の最小有効濃度を調べたところ、50%効果濃度(EC50[11]は182ナノモーラー(nM、1nMは10億分の1モーラー)であり、RM-A生産の増強に必要な濃度(350nM)に近い値でした。さらに、テトラヒドロ型BR-1はRM-A生産を増強しないが、プロモーター領域へのRevU結合も増強しないことが分かりました。

以上の結果から、revU遺伝子の活性化は、BR-1のRevUへの結合によって促進される機構を提唱しました(図3b)。

表面プラズモン共鳴を用いた結合解析の図

図3 表面プラズモン共鳴を用いた結合解析

a)左はBR-1非存在下、右はBR-1存在下でのRevUのプロモーター結合活性。BR-1(1.25μM)存在時に、結合が促進された。

b)推定されるLuxRファミリー転写因子(RevU)の発現増強機構。BR-1はRevUと結合することで、revU遺伝子の上流のプロモーター領域との結合を促進する。

さらに、BR-1とその誘導体が種の異なる放線菌の二次代謝産物の生産を誘発するか否かを検証しました。その結果、Streptomyces sp. RK95-74からは、ネオメディオマイシンB、Streptomyces sp. RK10-A626からは、m/z[12]が1032~1291の未知の二次代謝物の生産増加に成功しました。

今後の期待

本研究では、β-カルボリン化合物(BR-1)は、転写因子であるRevUと結合し、rev遺伝子クラスターを活性化することで、Streptomyces sp. SN-593におけるRM-A産生を選択的に増強する機構を発見しました。また、BR-1がRM-A生産菌だけでなく、他の放線菌(Streptomyces sp. RK95-74およびStreptomyces sp. RK10-A626)からの二次代謝物の産生を増強することも示しました。今後、BR-1およびその誘導体の処理により、RevUとの相同性が高いLuxRファミリー転写因子を持つ二次代謝生合成遺伝子クラスターを活用した新たな天然化合物の創出が期待できます。

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