スパコンを用いた長時間MDシミュレーションが解き明かす変異型EGFRタンパク質の構造と治療薬感受性

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2021-04-16 がん研究会,京都大学,日本医療研究開発機構

ポイント
  • これまで肺がんの臨床検体を利用して抗がん剤に対する薬剤感受性および抵抗性の分子基盤の研究が進められてきました。また、多くのがんで、EEGFR (Epidermal growth factor receptor: 上皮成長因子受容体) の突然変異が認められ、EGFR遺伝子ががん原遺伝子として働いていることが示されています。本研究グループは、多剤耐性EGFR変異(注1)肺がんにおける薬剤抵抗性についての新たな克服法の開発に取り組んできました。今回、EGFR-L747P変異体を詳細に解析し、新たな創薬につながる成果を発表しました。
  • EGFR変異肺がんの9割はEGFR-L858RまたはEGFR-exon19 (del19)欠損変異ですが、低頻度で様々な変異体(マイナー変異体)があり、その1つにEGFR-L747P変異があります。この変異について、EGFRチロシンキナーゼの活性化機構や薬剤感受性を高精度コンピュータ・シミュレーションにより明らかにしました。
  • EGFR-L747P変異体は第1世代EGFR阻害薬(ゲフィチニブ、エルロチニブ:注2)や、最近報告されたEGFRアロステリック阻害薬(注3)に耐性を示す一方で第2世代EGFR阻害薬アファチニブには感受性を示しましたが、これらの薬剤感受性について、変異体の共結晶構造がなくてもスーパーコンピュータを用いた分子動力学(Molecular Dynamics:MD)シミュレーション解析(注4)から説明可能となりました。
  • 主要なEGFR変異体(L858Rまたはdel19)では、抗EGFR抗体によりEGFR阻害薬(アファチニブなど)への感受性が増しますが、EGFR-L747P変異体では、抗EGFR抗体により感受性が変化しないことが判明しました。この理由について、マイクロ秒(100万分の1秒)タイムスケールの長時間MDシミュレーションにより構造面から推定可能になりました。
  • マイクロ秒タイムスケールの長時間分子動力学シミュレーションにより、EGFR-L747Pが常に活性化構造をとっていることが明らかとなり、不活性化構造に結合するタイプの阻害薬に抵抗性を示す理由を説明することができるようになりました。
  • 実験的検討からEGFR-L747P変異選択的に阻害活性を示す化合物を発見しました。
研究の概要

我が国のがんによる死因の第1位は肺がんであり、その約85%が非小細胞肺がんに分類(注5)されます。この非小細胞肺がんの半数近くの患者さんではEGFRの活性化変異が、がんの原因遺伝子として見つかり、EGFR阻害薬(EGFRチロシンキナーゼ阻害薬)は、がん細胞を増殖させる酵素(EGFR)を抑制する作用(治療効果)があります。EGFR変異肺がんの約90%の患者さんでは、EGFR-exon19 部分欠損変異(EGFR-del19)またはEGFR-L858R変異があり、これらの変異によりEGFRの活性が上昇することにより、がん化が促進されます。これらの肺がんは、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に高い感受性を示します(治療効果があります)。一方で残りの10%では、様々な種類のEGFR変異が同定されていますが、それらの特性、EGFR活性化機構、およびアロステリック阻害剤を含むさまざまなEGFR阻害薬に対する感受性については十分明らかになっていません。本研究において、我々は診断用のEGFR変異検査により、EGFR-del19変異と診断されたものの、次世代シーケンサーを用いた遺伝子変異解析からEGFR-L747P変異であることが判明した症例を経験しました。診断用のEGFR変異検査2種類を用いて患者検体由来DNAを再度試験した結果、いずれの検査方法でもEGFR-L747P変異はEGFR-del19と判定されてしまうことが確認されました。このEGFR-L747P変異について薬剤感受性並びに活性化機構等を、京都大学の奥野博士、荒木博士らとの共同研究により、スパコンを用いた高精度コンピュータシミュレーションにより解析しました。結合自由エネルギー計算とマイクロ秒タイムスケールの長時間分子動力学(MD:Molecular Dynamic)シミュレーションを実行し、L747P変異体ではEGFR活性化構造に重要なK745番目のリジン(K)と762番目のグルタミン酸(E)残基の間の塩橋が形成された安定な結合を常に維持していることが推定されました。さらにMDシミュレーションと結合自由エネルギー計算により、EGFR-L747P変異体はアロステリック阻害剤を含むいくつかのEGFR阻害剤に耐性であった理由を構造の面から明らかにすることができました。また、薬剤ライブラリーを用いたスクリーニングから、EGFR-L747P選択的に阻害活性を示す化合物を発見することにも成功しました。本研究で使用した高精度MDシミュレーションは、結晶構造解析がなされていない変異体の構造予測に強力なツールとなり、新たな創薬に活用できる可能性が示されました。


図:EGFRキナーゼ領域(野生型並びに変異体)の長時間MDシミュレーションから、野生型EGFRでは、構造が時折ダイナミックに変化する様子がとらえられ(a左)、EGFR-L747P変異ではK745とE762の間の塩橋(b)が形成され安定な構造を長時間とっている可能性が明らかにされました(a右)。aにおける矢印(赤線)はbで示した各構造状態の時点を示します。aの赤、緑、グレーの線はそれぞれ異なる試行回の長時間MDシミュレーション結果を示し、長時間MDシミュレーションによりはじめて大きな構造変化がとらえられることが判ります。


本研究は、がん研究会の片山量平(がん研究会 がん化学療法センター 基礎研究部)、西尾誠人(がん研究会 有明病院呼吸器内科)、奥野恭史(京都大学大学院 医学研究科)らの研究グループを中心としたメンバーによる共同研究にて行われました。

本研究の成果は、Nature Publishing Groupのパートナー誌であるNPJ Precision Oncologyに、2021年4月16日に公開されます。

論文名、著者およびその所属

論文名
Microsecond-timescale MD simulation of EGFR minor mutation predicts the structural flexibility of EGFR kinase core that reflects EGFR inhibitor sensitivity

ジャーナル名
NPJ Precision Oncology(Nature Publishing Groupのパートナー誌)

著者
Takahiro Yoshizawa1,2,3,4, Ken Uchibori1,2, Mitsugu Araki5, Shigeyuki Matsumoto6, Biao Ma7, Ryo Kanada6, Yosuke Seto1, Tomoko Oh-hara1, Sumie Koike1, Ryo Ariyasu2, Satoru Kitazono2, Hironori Ninomiya8, Kengo Takeuchi8, Noriko Yanagitani2, Satoshi Takagi1, Kazuma Kishi3,4, Naoya Fujita9, Yasushi Okuno5, Makoto Nishio2*, Ryohei Katayama1*
(* 責任著者)

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