細胞膜の受容体1分子の動きから薬効を評価~活性化したGPCR分子の動きは遅くなる~

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2018-09-19 理化学研究所,広島大学

理化学研究所(理研)開拓研究本部佐甲細胞情報研究室の柳川正隆研究員、阿部充宏専任研究員、佐甲靖志主任研究員、生命機能科学研究センター細胞シグナル動態研究チームの廣島通夫上級研究員、上田昌宏チームリーダーらの共同研究グループは、細胞の膜にある「Gタンパク質共役型受容体(GPCR)[1]」が薬を受けて活性化されると、動きが遅くなることを発見しました。

本研究成果は、1分子レベルで薬の作用機序を理解する1分子薬理学の発展や、1分子イメージングを用いたGPCR標的化合物の薬効評価という新たなドラッグスクリーニング手法の開発に貢献すると期待できます。

今回、共同研究グループは、全反射蛍光顕微鏡[2]を用いて、生きた培養細胞中で蛍光標識した9種類のGPCRの動画を撮影し、個々の受容体分子の動きを追跡することで、薬による受容体分子の振る舞いの変化を解析しました。その結果、9種のGPCRは、いずれも活性化すると動きが遅くなることが分かりました。また、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)[3]について、受容体の動きと機能の関係を2色同時1分子イメージングなどにより詳しく解析しました。その結果、Gタンパク質[4]と相互作用中の受容体は動きが速いものが多いのに対し、クラスリン[5]と相互作用中の受容体は動きが止まったものが多いことを明らかにしました。受容体の動きと機能の関係は多くのGPCRに共通しているため、動きを見ることで新規化合物がGPCRにどのような作用を及ぼすか推定できるようになると考えられます。

本研究は、米国の科学雑誌『Science Signaling』(9月18日号)に掲載されます。

図 全反射蛍光顕微鏡を用いて生細胞膜中のGPCR1分子の動きを見て薬効を評価

※研究グループ

理化学研究所
開拓研究本部 佐甲細胞情報研究室
研究員 柳川 正隆(やながわ まさたか)
専任研究員 阿部 充宏(あべみ つひろ)
主任研究員 佐甲 靖志(さこう やすし)
生命機能科学研究センター
細胞シグナル動態研究チーム
上級研究員 廣島 通夫(ひろしま みちお)
チームリーダー 上田 昌宏(うえだ まさひろ)

広島大学大学院 理学研究科
准教授 冨樫 祐一(とがし ゆういち)

京都大学大学院 理学研究科
助教 山下 高廣(やました たかひろ)
教授(研究当時) 七田 芳則(しちだ よりのり)
(立命館大学 総合科学技術研究機構教授)

東京大学大学院 総合文化研究科
教授 村田 昌之(むらた まさゆき)

※研究支援

本研究は、日本学術振興会(JSPS)科学研究費補助金若手研究B「GPCRの1分子動態・機能連関の比較解析(領域代表者:柳川正隆)」、同新学術領域研究「生命分子システムにおける動的秩序形成と高次機能発現」の研究課題「細胞膜受容体の動的会合体形成と分子認識反応(領域代表者:佐甲靖志)」をはじめ、基盤研究A「情報蛋白質のリン酸化による細胞記憶の新たな分子機構(領域代表者:佐甲靖志)」、基盤研究B「細胞膜情報処理装置の再構成(領域代表者:佐甲靖志)」、若手研究B「Gタンパク質共役型受容体のヘテロ多量体配置転換の解析(領域代表者:柳川正隆)」による支援を受けて行われました。

背景

「Gタンパク質共役型受容体(GPCR)」は、光・匂い・味・神経伝達物質・ホルモンなど細胞外のさまざまな刺激を受けGタンパク質を活性化することで、細胞内へと情報を伝える膜タンパク質の総称です。GPCRは薬の標的分子として主要な位置を占めており、米国食品医薬品局(FDA)承認薬の約34%がGPCRを標的としています注1)。現状、薬の標的として利用されているGPCRは、ヒトが持つ約800種のうち100種程度であり、まだ高い潜在性を持っています。このため、生きた細胞においてGPCRの活性を定量する手法の開発は、薬理学・創薬にとって基盤的な課題といえます。

従来は、細胞中のGPCRの活性を評価する場合、GPCR自体を見るのではなく、GPCRが薬を受けたときに引き起こすカルシウムイオン(Ca2+)や環状アデノシン一リン酸(cAMP)[6]の増減などの細胞応答を計測することが一般的でした。しかし、GPCRにより活性化されるGタンパク質の種類により、GPCRが引き起こす細胞応答は異なるため、全てのGPCRの活性を一つの手法で定量することは困難です。

また、細胞には活性化されたGPCRを不活性化する機構が備わっており、不活性化の過程を定量することも薬効を評価する上で重要です。GPCRが薬を受けると、Gタンパク質共役受容体キナーゼ(GRK)によってGPCRのC末端部位がリン酸化されます。このリン酸化部位を認識してアレスチン[7]が結合することで、GPCRはGタンパク質と結合できなくなります。GPCRと結合したアレスチンはさまざまなタンパク質と相互作用することが知られていますが、その代表的な分子がクラスリンです。クラスリンが細胞膜上で重合して形成されるクラスリン被覆ピット(直径100-200nmのくぼみ)は、GPCRを細胞内へと輸送し、リサイクル・分解する機構を担うことが知られています。

このようにGPCRは細胞膜上のさまざまな分子と相互作用することが知られていますが、一連の過程を単一細胞で同時に定量することはできていません。そこで、共同研究グループは、GPCRが引き起こす特定の細胞応答を測るのではなく、薬が結合することでGPCR分子自体に生じる振る舞いの変化から薬効を評価することができないか、生細胞内1分子蛍光イメージング注2)を用いて検証しました。

注1)Hauser et al. “Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications”, Nature Reviews Drug Discovery16:829–842 (2017)
注2)Sako Y, Minoguchi S, and Yanagida T., “Single-molecule imaging of EGFR signaling on the surface of living cells”, Nature Cell Biology 2:168–172 (2000)

研究手法と成果

共同研究グループは、まず、モデルケースとしてクラスCのGPCRの一つである代謝型グルタミン酸受容体(mGluR3)を用いた検証を行いました。ヒト胎児腎細胞由来のHEK293細胞において、mGluR3を蛍光色素で標識して全反射蛍光顕微鏡で観察しました(図1a)。撮影した動画の各mGluR3の輝点を追跡して軌跡を解析することで、受容体が細胞膜中を動く速さ(拡散係数)を定量できます(図1b)。さまざまな薬剤条件下で1分子イメージングを行い、拡散係数の平均値を比較したところ、mGluR3が活性すると動きが遅くなることが明らかになりました。

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