新しい1細胞遺伝子発現解析法の開発~1細胞中に転写されたRNAの5’末端を捉えるC1 CAGE法~

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2019-1-28 理化学研究所

理化学研究所(理研)生命医科学研究センター遺伝子制御回路研究チームの河野掌リサーチアソシエイト、ジェイ・シンチームリーダー、ライフサイエンス技術基盤研究センターゲノミクス微量技術開発ユニットのシャルル・プレシユニットリーダー(研究当時)、生命医科学研究センターのピエロ・カルニンチ副センター長らの共同研究グループは、1細胞中に存在する転写[1]されたRNA[1]の5’末端[2]を網羅的に捉え、遺伝子発現量を計測する方法を新たに開発しました。

本研究成果は、現在盛んに研究されている1細胞生物学分野の発展や「ヒト細胞アトラス計画[3]」の推進に貢献すると期待できます。

ゲノム[1]から転写されたRNAにはさまざまな種類があり、器官や臓器を構成する各細胞種は、RNAの種類や量によって特徴づけられています。しかし、1細胞における遺伝子発現は、たとえ同じ細胞種であっても不均一です。したがって、それぞれの細胞種を正しく理解するには、RNAを1細胞単位で網羅的に検出、定量する必要があります。しかし、これまでの技術では、さまざまな種類のRNAの検出に偏りがあったり、ゲノム中のどの位置からRNAが転写されたかという情報が失われたりするという問題がありました。 今回、共同研究グループは、「CAGE法[4]」と全自動単細胞単離核酸調整機「C1システム[5]」を組み合わせた「C1 CAGE法」を開発し、ゲノムから転写されたRNAの5’末端を偏りなく定量的に検出することで、これまで見逃されていた1細胞中に存在する転写されたRNAの挙動を捉えることに成功しました。

本研究は、英国のオンライン科学雑誌『Nature Communications』(1月21日付け)に掲載されました。

※共同研究グループ

理化学研究所 生命医科学研究センター
遺伝子制御回路研究チーム
リサーチアソシエイト 河野 掌(こうの つかさ)
研究員 柴山 洋太郎(しばやま ようたろう)
チームリーダー ジェイ・シン(Jay Shin)
ゲノム情報解析チーム
特別研究員 ジョナサン・ムーディー(Jonathan Moody)
チームリーダー ヂョンチョウ・ホン(Chung-Chau Hon)
トランスクリプトーム研究チーム
技師 加藤 紗智(かとう さち)
大容量データ管理技術開発ユニット
研究員 イマド・アブケセーサ(Imad Abugessaisa)
ユニットリーダー 粕川 雄也(かすかわ たけや)
ゲノム制御ネットワーク研究チーム
研究員 グォン・テジュン(Kwon Tae Jun)
チームリーダー エリック・アーナー(Erik Arner)
ライフサイエンス技術基盤研究センター ゲノミクス微量技術開発ユニット(研究当時)
ユニットリーダー(研究当時)シャルル・プレシ(Charles Plessy)
理化学研究所生命医科学研究センター
副センター長 ピエロ・カルニンチ(Piero Carninci)

背景

ヒトの体は約37兆個の細胞で構成され、全ての細胞には同じゲノムが存在すると考えられています。器官や臓器を構成する各細胞種は、ゲノムから転写されたRNAの種類や量によって特徴づけられています。しかし、1細胞における遺伝子発現は、たとえ同じ細胞種であっても不均一です。したがって、それぞれの細胞種を正しく理解するには、RNAを1細胞単位で網羅的に検出、定量する必要があり、近年、1細胞を対象とした研究が盛んに行われています。

特に、「トランスクリプトーム解析[6]」は新しい細胞種の同定などに有用であり、さまざまな実験手法が開発されています。しかし、ほとんどの手法では、さまざまな種類のRNAの中で、ポリA[7]修飾を受けている成熟RNAの3’末端[2]側を対象として定量を行います。そのため、その他のポリA修飾を受けていないRNAや、遺伝子発現を制御するプロモーター[8]の下流に存在し転写開始点となる5’末端側、RNAの転写の方向性といった重要な情報は得られませんでした。

共同研究グループは、国際研究コンソーシアム「FANTOM[9]」において、RNAの5’末端を選択的に捉えて定量を行う「CAGE法」を用いて、これまでにヒト細胞中のプロモーター、エンハンサーRNA[10]を同定することに成功しています注1)。しかし、従来のCAGE法では、多量の細胞からキットを用いてRNAを抽出する必要があり、1細胞を対象にすることは困難でした。

米国のFluidigm社は、独自に開発した全自動単細胞単離核酸調整機「C1システム」を用いて、1細胞中に転写されているポリA修飾を受けている成熟RNAの末端領域以外を検出、定量することを可能にしました。しかし、調整過程でポリA修飾を受けていないRNAやRNAの5’末端側の情報が失われるという問題がありました。

そこで、共同研究グループは、偏りなくRNAの5’末端を選択的に検出・定量する方法の開発に取り組みました。

注1)2014年3月27日プレスリリース「ゲノム上の遺伝子制御部位の活性を測定し正常細胞の状態を定義

研究手法と成果

共同研究チームは、Fluidigm社の全自動単細胞単離核酸調整機C1システムを用いて、1細胞中に転写されているごく微量のRNAから網羅的にRNAの5’末端を検出し、定量する「C1 CAGE法」を開発しました(図1)。C1 CAGE法では、逆転写プライマー[11]としてランダムプライマー[11]を使用することで、転写されていたRNAから偏りなくcDNA(相補的DNA)を合成します(逆転写反応)。また、cDNA合成時にTemplate Switching Oligo(TSO)[12]を用いて、RNAの5’末端に特異的な配列を付加させます。そしてcDNAの断片化後、RNAの5’末端となる領域をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)[13]により増幅し、ライブラリーを調整します。 また、独自に開発したデータベースSCPortalen[14]上でC1システムのマイクロ流路上に捕捉されている1細胞の画像データと、実際に次世代シークエンサー[15]により定量されたRNAの転写量を比較することで、実験データの解釈の効率を向上させました。

開発したC1 CAGE法が、正しくRNAの5’末端を捕捉し検出しているかを確認するために、既知のマウス由来のES細胞[16]を用いて、C1 CAGE法とポリA修飾を受けているRNAを対象とした既存の方法を比較しました。その結果、C1 CAGE法では、ポリA修飾を受けていないRNAも含めたRNAの5’末端を捉えており、さらに遺伝子検出の数も既存の方法よりも改善されていることが分かりました(図2)。

次に、C1 CAGE法が正しくプロモーターやエンハンサーの活性を捉えているかどうかを評価するために、実際にヒト肺がん上皮細胞をTGFβ[17]により刺激し、0、6、24時間後の時間経過に伴う遺伝子ネットワークの変化を、細胞をラベル後、観測しました。その結果、1細胞が持つ不均一な遺伝子発現から、刺激応答の強さに応じた四つの細胞状態を確認することができました。さらに、五つの遺伝子制御ネットワーク(抑制型、脆弱性応答型1、脆弱性応答型2、早期応答型、遅延応答型)が刺激後の細胞状態を決定づけていることが分かりました(図3)。

さらに、遺伝子領域外に存在し、遺伝子の転写活性を調整するエンハンサーRNAに着目しました。これまで、エンハンサーRNAは正と負の双方向に転写されており、その発現も低いと考えられていました。しかし、C1 CAGE法によって1細胞単位で発現を観察したところ、双方向に転写されている細胞は稀に存在するだけで、多くの細胞では片方向にしか転写されていないことが分かりました。また、ごく一部の細胞のみが、プロモーターと同程度の高い発現を示していることが明らかになりました。これらの発見は、単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション法[18]を用いて確認しました。

今後の期待

近年、1細胞中に存在する転写されたRNAを網羅的に定量する1細胞解析技術が盛んに行われていますが、多くの技術はポリAの修飾を受けた成熟RNAが対象であり、それ以外の転写されたRNAは見逃されがちです。しかし最近、これらのRNAが病気に関わっていることや、遺伝子の発現を制御していることが報告されています。本技術を用いて、1細胞中に転写された全てのRNAを検出、定量することは、各細胞の持つ不均一な発現を正確に理解する上で重要となります。

また、現在「ヒト細胞アトラス計画」が、世界中の研究者の協力の下で進行中です。集められたデータは、生命の理解や病気のメカニズムの解明に役立つと考えられており、本技術が新しい細胞種の発見などに貢献すると期待できます。

なお、関連する基礎情報は、論文発表と同時にWEBサイトZENBU[19]と、国立遺伝学研究所の日本DNAデータバンク(DNA Data Bank of Japan: DDBJ)のデータベース上で公開されます。また、C1 CAGE法はFluidigm社が管理するScript Hub上で公開されています注2)。

注2)Script Hub(英語サイト)

原論文情報

Tsukasa Kouno*, Jonathan Moody*, Andrew Kwon*, Youtaro Shibayama, Sachi Kato, Yi Huang, Michael Böttcher, Efthymios Motakis, Mickaël Mendez, Jessica Severin, Joachim Luginbühl, Imad Abugessisa, Akira Hasegawa, Satoshi Takizawa, Takahiro Arakawa, Masaaki Furuno, Naveen Ramalingam, Jay West, Harukazu Suzuki, Takeya Kasukawa, Timo Lassmann, Chung-Chau Hon, Erik Arner, Piero Carninci, Charles Plessy# and Jay W Shin#, “C1 CAGE detects transcription start sites and enhancer activity at single-cell resolution”, Nature Communications, 10.1038/s41467-018-08126-5
(*) Authors contributed equally
(#) Co-corresponding authors

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