光で活性化する組み換え酵素を、効率よく活性化する条件を発見

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2021-11-22 基礎生物学研究所

動物の体の中では、様々な遺伝子が働いています。特定の遺伝子を、特定の場所・時間で操作できることは、遺伝子の働きを知るのに有用であるため、これまで様々な手法が考えられてきました。近年、光によって活性化され、配列特異的に遺伝子を操作できる組み換え酵素「光活性化型Cre(Photoactivatable-Cre; PA-Cre)」が報告され、注目されています。基礎生物学研究所の岸香苗研究員、小山宏史助教、藤森俊彦教授らは、東京大学の佐藤守俊教授との共同研究により、PA-Creのマウス個体での実用化を目指しました。光を当てた場所と時期だけで遺伝子組み換えを起こすことができるこの手法をマウス個体で実用化することは大変有用ですが、強い光を当て続けると細胞にダメージを与えることが課題でした。研究チームは、ES細胞や数理モデルを用いて、効率よく組み換えを誘導できる光照射条件を探索しました。その結果、短い間隔で光のON/OFFを繰り返す光照射を行うと、照射時間は半分になるにもかかわらず、連続照射(当てっぱなし)と同等の効率で組み換えを誘導できることがわかりました。本研究成果は、Genesis誌に掲載されました。

【研究の背景】
組み換え酵素であるCre recombinaseは、loxPと呼ばれる短い配列間で組み換えを起こすことができます。細胞・組織・時期特異的に遺伝子を発現させる、遺伝子配列を除去するなどの操作にCreによる組換えが用いられてきました。Creの活性制御の手法として、プロモーターによるCre遺伝子の発現制御や、薬剤によるCreの酵素活性制御に加え、光によって活性化する「光活性化型Cre(Photoactivatable-Cre; PA-Cre)」が近年報告されています。光活性型Creは、光を当てるとくっつきあうことが知られているタンパク質(Magnet)に、2つに分けたCreをつなげたものです。光を当てた時だけCreが活性化されることが、細胞での実験で報告されています。このPA-Creをマウス個体、特に着床前の胚で実用化することを目指しました。
図1:光活性型Creの模式図。青い光を当てた時だけくっつくタンパク(グレー)と、2つにわけた組み換え酵素(緑と赤)を組み合わせた人工タンパク質です。

【研究の成果】
PA-Creを発現するトランスジェニックマウスを作出し、光を当てた時に組み換えを起こす複数系統のマウスを得ました。しかし、PA-Creの組み換えを誘導する際に、強い光を当て続けると、細胞にダメージを与えてしまいます。そのため、ダメージを抑えながら効率よく組み換えを誘導できるような光照射条件を探索しました。
手軽に様々な条件を検討するために、PA-Creマウスと、Creによる組み換えが起こった時のみ細胞膜に蛍光タンパク質が局在するマウス(R26-Lyn-Venus(flox/flox)マウス)の掛け合わせにより得られた胚から、ES細胞を樹立しました。このES細胞を用いて、いろいろな光照射条件を試した結果、「1分以内の短い間隔で光のON/OFFを繰り返す」ことによって、合計の光照射時間を半分に抑えながら、連続照射(あてっぱなし)と同じくらいの効率で組み換えを誘導できることがわかりました。また、PA-Creの活性化状態と非活性化状態の2状態からなるシンプルな数理モデルを用いて、この現象が説明できることがわかりました。さらに同じモデルから、この現象には「光を当てたときに素早くくっついて活性化する」一方で「光を消してもすぐには離れず、不活性になりにくい」という今回用いたPA-Creの性質が重要であることがわかりました。最後に、この短いON/OFFの光照射は、細胞だけではなくマウスの胚においてもPA-Creによる組み換えを誘導できることが示されました。
fig2.jpg図2:光照射の模式図と、組換え効率のグラフ。ON/OFFの繰り返し(薄青)によって、当てっぱなし(濃青)の半分の照射時間で、同等の組み換えを起こすことができました。グラフの縦軸は組み換え効率(360分当てっぱなしを1としたもの)、横軸は繰り返し照射時の、1回のONの時間です。ONの時間とOFFの時間は同じです。たとえば、2秒のバーは、2秒ON→2秒OFF→2秒ON→……を合計360分繰り返した時の組み換え効率を示しています。「1分以内の短い間隔で光のON/OFFを繰り返す(グラフ、1分、10秒、2秒)」ことで、合計の光照射時間を半分に抑えながら、連続照射(グラフ、360分)と同じくらいの効率で組み換えを誘導できました。
fig3.jpg
図3:PA-Creマウスと、Creで組換えが起こると細胞膜が黄色く光るマウスを掛け合わせた着床前の胚に、光をあてたものです。一部の細胞で組み換えを起こすことができました(左の胚)。黄色は組み換えが起こった細胞。青はすべての細胞核を染色しています。

【今後の展望】
マウスの胚で、光によって組み換え誘導ができる系ができました。マウスの着床前胚の特定の細胞集団で遺伝子を改変し、その後胚移植を行うことで、細胞系譜の解析や、遺伝子のはたらきを調べる実験などに応用が可能となります。また「短い間隔でのON/OFFを繰り返す」という、胚へのダメージを抑えて効率よく活性化を促す条件は、PA-Creはもちろん、ほかの光活性化型タンパク質への応用も期待されます。

【発表雑誌】
雑誌名 genesis: The Journal of Genetics and Development
掲載日 2021年10月23日
論文タイトル: Repetitive short-pulsed illumination efficiently activates photoactivatable-Cre as continuous illumination in embryonic stem cells and pre-implantation embryos of transgenic mouse
著者:Kanae Kishi, Hiroshi Koyama, Sanae Oka, Azusa Kato, Moritoshi Sato, Toshihiko Fujimori
DOI:10.1002/dvg.23457

【研究グループ】
本研究は、基礎生物学研究所 初期発生研究部門の岸香苗研究員、小山宏史助教、藤森俊彦教授らが中心となって、東京大学の佐藤守俊教授との共同研究として行われました。

【研究サポート】
本研究は、科学技術振興機構(CREST JPMJCR1654)の支援を受けて実施されました。

【本研究に関するお問い合わせ先】
基礎生物学研究所 初期発生研究部門
教授 藤森 俊彦(フジモリ トシヒコ)

【報道担当】
基礎生物学研究所 広報室

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