オートファジー遺伝子の縮小進化

ＡＴＧ１２結合系の共有結合から非共有結合への進化

2019-03-26　東京大学,科学技術振興機構

ポイント

オートファジーを起こすためには、ＡＴＧたんぱく質群のうち、ＡＴＧ１２とＡＴＧ５が共有結合によって連結しなければならないことが知られていました。
今回マラリア原虫やトキソプラズマのような寄生虫、一部の酵母では、ＡＴＧ１２とＡＴＧ５が非共有結合によって結合していることを発見し、高度に保存されているオートファジー遺伝子も進化の過程で大きく変化し得ることを明らかにしました。
共有結合によるたんぱく質の連結は、たんぱく質のユビキチン化などにおいて広く見られますが、本研究成果は、共有結合性複合体の一部は、より単純な非共有結合性複合体へと進化し得ることを示しました。

たんぱく質がその機能を発揮するためには、さまざまな分子の共有結合^注１）による修飾を受けることがあります。その１つがたんぱく質同士の共有結合で、たんぱく質のユビキチン化^注２）などで広く見られます。細胞内の主要分解系として知られるオートファジー^注３）において重要な役割をつかさどるオートファゴソームという膜構造体は、多数のＡＴＧたんぱく質群によって作られますが、その中のＡＴＧ１２とＡＴＧ５も共有結合によって連結して働いています（図１、図２）。これは酵母や動植物などを含む、全ての生物で共通であると考えられてきました。

今回、東京大学大学院医学系研究科の水島昇　教授らの研究グループは、中国農業科学院ハルビン獣医研究所のＨｏｎｇｌｉｎＪｉａ（ホンリン・ジア）　准教授、京都大学大学院農学研究科の阪井康能　教授、微生物化学研究会の野田展生　部長、長崎大学大学院熱帯医学・グローバルヘルス研究科の北潔　教授らのグループと共同で、マラリア原虫やトキソプラズマのような寄生虫や一部の酵母では、ＡＴＧ１２とＡＴＧ５が非共有結合^注４）による複合体として機能していることを発見しました。本研究成果は、高度に保存されているオートファジー遺伝子も進化の過程で大きく変化していることを示すとともに、結合が強い共有結合性のたんぱく質複合体の一部が、結合が弱い非共有結合性のたんぱく質複合体へと縮小進化し得ることを示しました。

本研究成果は、２０１９年３月２５日（英国時間）に「ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」オンライン版で公開されました。

本研究は科学技術振興機構（ＪＳＴ）戦略的創造研究推進事業総括実施型研究（ＥＲＡＴＯ）「細胞内分解ダイナミクスプロジェクト」（研究総括：水島昇）および日本学術振興会　新学術領域研究「オートファジーの集学的研究」（領域代表：水島昇）の計画研究「オートファジーの生理・病態生理学的意義とその分子基盤」として行われました。

＜発表内容＞

（１）研究の背景

オートファジーは、細胞内の主要な分解系であり、飢餓時の栄養のリサイクルや細胞内の構成成分の品質の維持に重要な役割を果たします。オートファジーでは、オートファゴソームという特殊な膜構造体が細胞内のたんぱく質や細胞小器官を取り囲み、リソソームと呼ばれる細胞小器官と融合し、リソソームに含まれる多数の分解酵素によって最終的に分解に至ります（図１）。オートファゴソームの形成には数多くのＡＴＧたんぱく質群が必要であり、その多くは２０１６年のノーベル医学・生理学賞を受賞した大隅良典　博士（現所属：東京工業大学　栄誉教授）らのグループなどにより同定されてきました。その１つであるＡＴＧ１２たんぱく質が機能するためは、ＡＴＧ５という別のたんぱく質と共有結合する必要があることが１９９８年にサッカロミセス酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、出芽酵母の一種）で明らかになりました（図２）。このＡＴＧ１２共有結合システムは、オートファジーとは別の選択的たんぱく質分解機構で用いられる「ユビキチン化」と類似しており、たんぱく質同士の共有結合による修飾という概念の拡大にも貢献しました。

その後の研究から、オートファジーの中にさらにもう１つ類似した共有結合システムがあることも分かりました。それはＡＴＧ８というＡＴＧ１２と似たたんぱく質が、リン脂質の１種類であるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と共有結合するというものです（図２）。ＡＴＧ８はほとんどの生物ではオートファゴソームの膜に、マラリア原虫などではアピコプラスト膜^注５）に存在しています。さらに、ＡＴＧ１２とＡＴＧ５の共有結合体（ＡＴＧ１２－ＡＴＧ５複合体）は、ＡＴＧ８とリン脂質の共有結合を促進するという、２つのシステムの関係も明らかとなりました（図２、＋の矢印の経路）。ＡＴＧ１２とＡＴＧ８の２つの共有結合システムは、サッカロミセス酵母だけではなく、動物や植物などで調べられた全ての生物におけるオートファゴソーム形成に必要なことが分かり、これまでの２０年間にわたって、オートファジーの中心的な分子機構であると考えられてきました。

（２）研究の内容

本研究では、まずマラリア原虫やトキソプラズマのような寄生虫でのＡＴＧ１２共有結合システムの存在を調べました。その結果、ＡＴＧ１２とＡＴＧ５の共有結合に必要な酵素であるＡＴＧたんぱく質群の１つであるＡＴＧ１０の遺伝子がゲノムに存在しないことや、ＡＴＧ５との共有結合に必要なＡＴＧ１２の末端のグリシン残基が欠損していることが分かりました（図２）。実際に、これらの寄生虫ではＡＴＧ１２とＡＴＧ５は共有結合できないことも判明しました。しかし、動植物やサッカロミセス酵母と異なり、ＡＴＧ１２とＡＴＧ５は、結合が弱い非共有結合による単純な複合体を形成しており、それがＡＴＧ８とリン脂質の結合を促進していることが明らかとなりました（図３）。つまり、マラリア原虫やトキソプラズマなどの寄生虫には共有結合性のＡＴＧ１２－ＡＴＧ５複合体を形成するための「ＡＴＧ１２結合システム」がないことが分かりました。これまで調べられていた生物では、ＡＴＧ８とリン脂質の結合の促進には、共有結合性のＡＴＧ１２－ＡＴＧ５複合体が必要と考えられてきましたが、非共有結合性の複合体でも、ＡＴＧ８とリン脂質の結合を促進できることを示しています。

さらに、マラリア原虫やトキソプラズマなどの寄生虫だけではなく、いくつかの真菌でもこのようなＡＴＧ１２結合システムの共有結合から非共有結合への進化が起こっていることも分かりました（図４）。実際の実験によっても、コマガタエラ酵母（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａｐｈａｆｆｉｉ）、なかでも異種たんぱく質生産に用いられているメタノール資化性酵母（旧名Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）では非共有結合性のＡＴＧ１２－ＡＴＧ５複合体がオートファジーに必要であることが明らかになりました。

本研究成果は、高度に保存されているオートファジー遺伝子も進化の過程で変化していることを示しました。また、ユビキチン化などに代表される共有結合性たんぱく質複合体の一部は、より単純な非共有結合性たんぱく質複合体へと進化し得ることを示しました。最終的なＡＴＧ１２の結合相手はＡＴＧ５だけなので、そのために特異的な酵素やエネルギーを必要とする共有結合系を維持するよりは、エネルギーを必要としない単純な非共有結合を可能とする結合面を形成する方が生存に有利であったと考えられます。

（３）社会的意義

マラリアやトキソプラズマ症はまだ世界で多くの感染者がいます。特に、薬剤耐性のマラリアは深刻な問題になっています。ＡＴＧ１２やＡＴＧ８結合システムはマラリア原虫やトキソプラズマの必須小器官であるアピコプラストの合成に必要であるため、今回の非共有結合性のＡＴＧ１２－ＡＴＧ５複合体の発見は、マラリアやトキソプラズマ症の制御のための新しいターゲットとなり得る可能性があります。また、非共有結合性のＡＴＧ１２－ＡＴＧ５複合体が発見されたコマガタエラ酵母は、人工的なたんぱく質生産系として用いられているため、その効率向上に向けた有用情報を提供するものと期待されます。

＜参考図＞

図１　オートファジーの仕組み

オートファジーが誘導されると、オートファゴソームが細胞質成分を取り囲みながら形成される。続いてオートファゴソームはリソソームと融合し、オートファゴソームで囲んだ細胞質成分が分解される。細胞質成分の分解により生じたアミノ酸などの分解産物は再利用される。

図２　共有結合によるたんぱく質同士の結合システムの例（ＡＴＧ１２結合システム、ＡＴＧ８結合システムおよびユビキチン結合システム）

（１）共有結合によるＡＴＧ１２結合システム。ユビキチン類似たんぱく質であるＡＴＧ１２の末端のグリシン（Ｇ）が酵素ＡＴＧ７によってエネルギー（ＡＴＰ）依存的に活性化され、次に酵素ＡＴＧ１０に受け渡され、最終的にＡＴＧ５に共有結合する。マラリア原虫などでは、ＡＴＧ１２の末端グリシンやＡＴＧ１０が欠損している。

（２）ＡＴＧ８結合システム。ユビキチン類似たんぱく質であるＡＴＧ８も同様に２つの酵素（ＡＴＧ７とＡＴＧ３）の働きと、ＡＴＧ１２－ＡＴＧ５共有結合体の働きによって（＋の矢印）リン脂質であるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と共有結合する。ＡＴＧ８はほとんどの生物ではオートファゴソーム膜に、マラリア原虫などではアピコプラスト膜に存在する。

（３）ユビキチン結合システム。ユビキチンの末端のグリシン（Ｇ）がＥ１酵素によってエネルギー依存的に活性化され、次にＥ２酵素に受け渡され、多くの基質に共有結合する。ＡＴＧ１２とＡＴＧ８のシステムはこのユビキチン化とよく似ている。

図３　ＡＴＧ１２結合の共有結合から非共有結合への進化

サッカロミセス酵母、動物、植物などで見られるエネルギー（ＡＴＰ）を必要とするＡＴＧ１２共有結合システムは、エネルギーを必要とせず単純な非共有結合性のたんぱく質複合体形成へと進化している。ＡＴＧ８のリン脂質修飾を促進するという機能はどちらのシステムも持っている。

図４　主要な真核生物におけるＡＴＧ１２結合システムの進化の概略

ＡＴＧ１２とＡＴＧ５の共有結合があることがこれまで分かっていた、サッカロミセス酵母、ヒトを含む動物、植物（破線四角）と、今回明らかになった、ＡＴＧ１２とＡＴＧ５の結合が非共有結合になったもの（実線四角）をハイライトした。

＜用語解説＞

注１）共有結合: 原子と原子の間で電子対を共有することで形成される強力な化学結合。分子の中での原子の結合は基本的に共有結合であり、直線で表されることが多い（例：水分子の酸素と水素の結合、１本のＤＮＡ中の塩基と塩基の結合、たんぱく質中のアミノ酸の結合など）。分子と分子が共有結合することもある。共有結合を形成するには大きなエネルギーが必要である。熱や薬剤によって乖離しないほど、結合が強い。

注２）ユビキチン化: ユビキチンは７６個のアミノ酸からなる進化的に高度に保存されたたんぱく質である。ユビキチンは、エネルギー依存的な酵素反応によって他のたんぱく質に共有結合することができ、この反応をユビキチン化という（図２）。４つ以上のユビキチンが結合すると、それが分解の標識となって、ユビキチン化されたたんぱく質はプロテアソームによって分解される。分解誘導がユビキチンの最も重要な機能であるが、ユビキチンには他の働きがあることも分かっている。

注３）オートファジー: 細胞の主要な分解機能の１つ。オートファゴソームが細胞質成分（細胞質ゾルやミトコンドリアなどの細胞内小器官）を取り囲み、リソソーム（分解酵素を格納している細胞内小器官）と融合することで分解する仕組み（図１）。その生理的機能としては、飢餓への適応や細胞内の恒常性維持などが知られており、近年では特に神経変性疾患などとの関連が注目されている。大隅良典　博士のグループなどによるこれまでの研究で、数多くのＡＴＧたんぱく質群がオートファゴソームの形成に関わっていることが明らかにされてきた。

注４）非共有結合: 電子対の共有を伴わない結合で、分子と分子の結合は一般に非共有結合である（例：水分子と水分子の結合、２本のＤＮＡ間の結合、一般的なたんぱく質同士の結合など）。イオン間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力による結合などによる。静電的な結合であるため、エネルギーを必要としない。共有結合と比較すると結合は弱い。

注５）アピコプラスト膜: マラリア原虫やトキソプラズマなどのアピコンプレクサ類に属する原虫に特有の小器官で、生存に必要である。葉緑体が起源であると考えられるが、光合成はしない。これらの原虫では、ＡＴＧ８結合系はアピコプラストの合成や分配に必要であると考えられている。オートファゴソームとアピコプラストには直接の関係がなく、なぜ両者に共通の仕組みが使われているかは不明である。

＜論文情報＞

タイトル: “Evolution from covalent conjugation to non-covalent interaction in the ubiquitin-like ATG12 system”
著者: Yu Pang, Hayashi Yamamoto, Hirokazu Sakamoto, Masahide Oku, Joe Kimanthi Mutungi, Mayurbhai Himatbhai Sahani, Yoshitaka Kurikawa, Kiyoshi Kita, Nobuo N. Noda, Yasuyoshi Sakai, Honglin Jia, and Noboru Mizushima
ＤＯＩ: 10.1038/s41594-019-0204-3