脳の深部を非侵襲的に観察できる人工生物発光システムAkaBLI

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霊長類動物にも適用可能、高次脳機能のリアルタイム可視化への応用

2018-02-23 理化学研究所,日本医療研究開発機構
革新的技術による脳機能ネットワークの全容解明プロジェクト

要旨

理化学研究所(理研)脳科学総合研究センター細胞機能探索技術開発チームの宮脇敦史チームリーダー(光量子工学研究領域生命光学技術研究チーム チームリーダー)と岩野智基礎科学特別研究員らの共同研究グループは、ホタルが産生する化合物(基質)とタンパク質(酵素)をベースに新規の人工生物発光システムAkaBLIを開発し、生きた動物個体深部からのシグナル検出能を飛躍的に向上させました。

AkaBLIは、2013年に開発した人工基質AkaLumineと、AkaLumineに合わせて今回開発した人工酵素Akalucから構成されます。動物個体のバイオイメージングにおいては、一般的にホタルの生物発光システム(天然基質D-luciferin[1]と天然酵素Fluc[2])が用いられていますが、AkaBLIを用いると深部からの発光シグナルを従来と比べ100~1,000倍の強さで検出できることが分かりました。

具体的には、マウスの線条体[3](大脳皮質下の領域)の中の標識神経細胞からの発光を、無麻酔かつ自由行動の状態で非侵襲的に可視化することに成功しました。同様に、マーモセット(霊長類動物)の成体でも可視化を実現しました。また、マウス海馬のわずか数十個の神経細胞がさまざまな環境の変化に応じて興奮する様子を、同一動物個体を使って追跡することができました。昨今、脳深部を観察する光学的技術として例えば蛍光内視鏡が注目されていますが、強い侵襲性と狭い観察視野が問題となっています。AkaBLIを使えば、注目する神経回路を遺伝的にAkalucで標識し、その活性化を非侵襲的かつ包括的にモニタすることができます。本成果は、高等動物の高次脳機能をより自然な状況で解析するための技術として期待できます。

また、Akalucで標識した腫瘍細胞がマウスの肺の毛細血管にトラップされる現象を一細胞レベルで可視化することにも成功しました。AkaBLIは、少数の腫瘍細胞や幹細胞の新生や移入、さらにその後に起こる生着、増殖、転移などの現象を高感度にかつ定量的に観察することを可能にし、動物個体を扱う生命科学分野で幅広い活躍が期待されます。

本研究は、米国の科学雑誌『Science』(2月22日付け:日本時間2月23日)に掲載されました。

本研究は、日本学術振興会(JSPS)科学研究費補助金 新学術領域「共鳴誘導で革新するバイオイメージング(領域代表者:宮脇敦史)」および日本医療研究開発機構(AMED)「革新的技術による脳機能ネットワークの全容解明プロジェクト」の支援を受けて行われました。

※共同研究グループ
理化学研究所 脳科学総合研究センター
細胞機能探索技術開発チーム
チームリーダー 宮脇 敦史 (みやわき あつし)
基礎科学特別研究員 岩野 智 (いわの さとし)
神経回路・行動生理学研究チーム
チームリーダー トーマス・ジョン・マックヒュー(Thomas John McHugh)
基礎科学特別研究員 田中 和正 (たなか かずまさ)
脳機能ネットワークの包括的解明プロジェクト
高次機能分子解析チーム
チームリーダー 山森 哲雄 (やまもり てつお)
研究員 渡我部 昭哉(わたかべ あきや)
マーモセット神経構造研究チーム
チームリーダー 岡野 栄之 (おかの ひでゆき)
研究員 畑 純一 (はた じゅんいち)
電気通信大学 大学院情報理工学研究科 先進理工学専攻
助教 牧 昌次郎 (まき しょうじろう)
京都大学大学院 医学系研究科
助教 日置 寛之 (ひおき ひろゆき)
東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系
教授 近藤 科江 (こんどう しなえ)
助教 口丸 高弘 (くちまる たかひろ)
背景

生物発光は基質(ルシフェリン)と酵素(ルシフェラーゼ)から構成され、ルシフェリンがルシフェラーゼによって酸化されることで発光が起こります。生物発光のバイオイメージングでは、主に2種類のルシフェリンが用いられています。セレンテラジン[4]とD-luciferinです。

セレンテラジンは海に棲む生物発光動物が共有するルシフェリンで、その発光色は青色領域にあります。例えばRluc[5](ウミシイタケに由来)などのルシフェラーゼがセレンテラジンを効率よく酸化します。セレンテラジンとRlucの組み合わせは、試験管内や培養細胞の系で非常に強いシグナルをもたらす生物発光システムとして重宝されています。ただし、動物体内に入るとセレンテラジンは不安定で、ルシフェラーゼに到達する前に分解するかまたは酸化して光ってしまいます。

D-luciferinはホタルなどの陸生生物の生物発光に認められる基質で、発光色は黄緑色領域にあります。D-luciferinに対応するルシフェラーゼとしては、ホタルのFlucが最も有名です。D-luciferinは動物体内において安定しており、これとFlucのペアが動物個体バイオイメージングの世界標準として用いられています。

しかしD-luciferinにも重大な問題があります。組織透過性があまりよくないので、動物体内で不均一に分布してしまうのです。動物個体の生物発光バイオイメージングでは、あくまでもルシフェラーゼ酵素の遺伝子発現の量に比例してシグナル量が決定されるべきなのに、むしろルシフェリン基質の濃度によってシグナルの強弱が変わる状況が多いです。さらに、D-luciferinは血液脳関門(BBB)[6]を通過しにくいので、腹腔内投与[7]や経静脈投与[8]で体内に送り込まれても、脳内で発現するルシフェラーゼまで到達しないという問題があります(図1)。

そこでD-luciferinの誘導体が作製されました。2013年に、電気通信大学の牧研究室で合成されたのがAkaLumineという化合物です注1)。D-luciferinに比べて際立った長所が二つあります。第一にAkaLumineそのものの組織透過性がよいこと、第二にAkaLumineは組織透過性の高い赤色光を発することが挙げられます。実際にAkaLumineとFlucのペア(図2)を使うと、動物個体深部のイメージングの性能が向上することが明らかにされています。

注1) Iwano S et al., “Development of simple firefly luciferin analogs emiting blue, green, red, and near-infrared biological window light.” Tetrahedron 69, 3847-3856 (2013).

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