超微量糖鎖分析法を開発

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次世代がん診断や創薬へ貢献

2018/07/26 理化学研究所

理化学研究所(理研)生命機能科学研究センター 一細胞質量分析研究チームの川井隆之研究員、集積バイオデバイス研究ユニットの太田亘俊研究員、田中陽ユニットリーダーらの共同研究チームは、わずか100細胞程度の超微量試料からN結合型糖鎖[1]を超高感度でプロファイリングできる「超微量糖鎖分析法」を開発しました。

本研究成果は、これまで検出が難しかった微量血中糖鎖を用いた次世代がん診断や、細胞数の少ない初期がんや難治性がんなどを対象とした創薬に貢献すると期待できます。

今回、共同研究チームは、高感度な糖鎖分析法として知られる「キャピラリー電気泳動[2]-レーザー励起蛍光[3](CE-LIF)分析法」において、糖鎖を2,000倍以上濃縮できる「新しい濃縮法(LDIS法[4])」を開発し、検出下限濃度350fmol/L(フェムトモーラー、1,000兆分の1モル濃度)という超高感度を実現しました。これは、東京ドーム3杯分の水に対して角砂糖1個分に相当します。LDIS法は、これまでの濃縮法では排除できなかった、不純物による悪影響をほとんど受けない優れた特性があります。これにより、100細胞という超微量の細胞から抽出された糖鎖をほとんどロスすることなく、濃縮・分離・検出することに成功しました。

本研究は、国際科学雑誌『Journal of Chromatography A』オンライン版(6月23日)に掲載されました。わずか100個の細胞から、肝臓がんに特徴的な糖鎖プロファイリングに成功!の図

※共同研究チーム

理化学研究所 生命機能科学研究センター

一細胞質量分析研究チーム

研究員 川井 隆之(かわい たかゆき)

研究パートタイマーⅡ 今里 亜貴子(いまさ とあきこ)

研究パートタイマーⅡ 白﨑 葉子(しらさき ようこ)

集積バイオデバイス研究ユニット

研究員 太田 亘俊(おおた のぶとし)

ユニットリーダー 田中 陽(たなか よう)

※研究支援

本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)糖鎖利用による革新的創薬技術開発事業「超高効率濃縮法に基づくCE-LIF-MS微量糖鎖分析システムの開発 (研究代表者: 川井隆之)」および科学技術振興機構(JST)戦略的創造研究推進事業さきがけ「超高感度CE-MS分析システムによる極微量プロテオーム解析 (研究代表者: 川井隆之)」などによる支援を受けて行われました。

背景

糖鎖とは、単糖[5]であるマンノースやシアル酸などが数個以上、枝分かれしながら結合した物質です。タンパク質を構成するアミノ酸の一つアスパラギンに結合する糖鎖はN結合型糖鎖と呼ばれ、細胞ががん化するなど病変する際には、この糖鎖の構造が変化することが知られています。このような疾患特異的に変異する糖鎖を標的とした医薬品を開発できれば、これまでよりも副作用が少なく効果の高い画期的な治療を実現できると期待されています。

病変細胞を採取して解析する場合、まず組織切片を染色して顕微鏡で観察しながら病変細胞を切り取りますが、多くの場合1,000細胞未満のわずかな量しか得ることができません。高感度なN結合型糖鎖分析法として知られる「キャピラリー電気泳動-レーザー励起蛍光(CE-LIF)分析法」であっても、最低でも10,000細胞以上の試料が必要であり、病変細胞のみを糖鎖分析にかけることはできませんでした。

研究手法と成果

共同研究チームは、高感度なCE-LIF分析法をさらに大幅に高感度化するため、キャピラリー内部で糖鎖を効率的に濃縮する手法の開発を行いました。これまでにもさまざまな濃縮法が開発され、感度だけであれば10万倍もの濃縮が実現された例もありました。しかし、生体試料に含まれるさまざまな夾雑(きょうざつ)物質の影響を受けずに、微量の細胞から生じる貴重な糖鎖を余すことなく濃縮し、分離・検出できる手法は全く存在しませんでした。

そこで今回、試料をロスすることなく、効率的に濃縮と分離を行えるLVSS法[6]と、夾雑物質に強い過渡的等速電気泳動(tITP)法[7]を組み合わせ、新たな濃縮法である「LDIS法」を開発しました。LDIS法では、キャピラリーに注入された大量の糖鎖溶液は、まずLVSS法の原理によって濃縮された後、tITP法の原理に従って再度濃縮されます。その後、CE-LIF分析法により、サイズが小さい糖鎖の順番に分離・検出されます(図1)。

開発したLDIS法の性能を検証するため、まず糖鎖を8-アミノピレン-1,3,6-トリスルフォン酸(APTS)と呼ばれる蛍光色素で標識しました。APTSで標識することで、通常の方法では分離も検出もできない糖鎖を、サイズの小さい順にキャピラリー電気泳動(CE)で分離してレーザー励起蛍光(LIF)検出することができます。

糖鎖標準品であるグルコースオリゴマー(ブドウ糖が1~15個程度ランダムにつながった糖鎖、G1~G15)を、①濃縮なし、②従来のLVSS法による濃縮、③LDIS法による濃縮の条件で、それぞれCE-LIFを行い比較したところ、濃縮なしと比較してLDIS法による濃縮では約2,300倍もの高感度化を達成しました(図2)。このとき検出できる最小濃度は、わずか350fmol/Lでした。これは、30億リットル(東京ドーム3杯分)の水に、角砂糖1個程度(3g)を溶かした超希薄濃度の糖鎖を検出できる性能です。また、糖鎖と関係のない夾雑物質濃度が10mmol/L(1リットルに角砂糖1個程度)という汚い試料であっても、分析性能の低下はありませんでした。

次に、このLDIS法を使って、実際に100細胞程度の試料を測定できるか検証しました。まず、さまざまな濃度のHeLa細胞(子宮頸がん由来)の溶解液(試験管あたり100個から100,000個)からペプチド-N-グルコシダーゼFという酵素を用いて糖鎖を切り出し、蛍光色素APTSで標識して分析を行ったところ、細胞の量にかかわらず同様のピークパターンが得られることが分かりました(図3)。これは、どんな構造の糖鎖がそれぞれどれくらいの量含まれるかを調べるプロファイリング解析において、微量の細胞であっても分析信頼性が失われていないことを示しています。

最後に、複数種類の細胞株に対して、約100細胞程度の試料から糖鎖プロファイリングを行いました。肝臓がん由来のHepG2細胞、乳がん由来のMCF7細胞、子宮頸がん由来のHeLa細胞をそれぞれ解析したところ、特にHepG2細胞において著しく異なるプロファイルが得られました。各ピークの検出時間からグルコースユニット[8]と呼ばれる値を算出してデータベースと照合することで、各ピークの糖鎖構造を推定したところ、HepG2ではN-アセチルノイラミン酸[9]などシアル酸の多い糖鎖プロファイルが得られていることが分かりました(図4)。

今後の期待

今回、100細胞という微量糖鎖であっても、十分な感度と信頼性でN結合型糖鎖のプロファイリングが可能であることが実証されました。今後、実際の病理切片や血液試料などからの疾患特異的な糖鎖バイオマーカーの検出に応用することで、新たながん診断法や新治療薬の開発につながると期待できます。

また、今回開発したLDIS法は、糖鎖のみならず他のさまざまな生体関連物質を効率的に濃縮できる手法です。特に組織微小領域や、一細胞レベルでの代謝物解析・タンパク質解析などに適用することで、新たな生命現象の解明、疾患メカニズムの解明など、医療・創薬への貢献が期待できます。

原論文情報
  • Takayuki Kawai, Nobutoshi Ota, Akiko Imasato, Yoko Shirasaki, Koji Otsuka, Yo Tanaka, “Profiling of N-linked glycans from 100 cells by capillary electrophoresis with large-volume dual preconcentration by isotachophoresis and stacking”, Journal of Chromatography A, 10.1016/j.chroma.2018.06.034
発表者

理化学研究所

生命機能科学研究センター 一細胞質量分析研究チーム

研究員 川井 隆之(かわい たかゆき)

生命機能科学研究センター 集積バイオデバイス研究ユニット

研究員 太田 亘俊(おおた のぶとし)

ユニットリーダー 田中 陽(たなか よう)

 

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