トランスゴルジ網の時空間ダイナミクス～積荷タンパク質の入口と出口の区画化が明らかに～

2019-07-11  理化学研究所

理化学研究所(理研)光量子工学研究センター生細胞超解像イメージング研究チームの戸島拓郎研究員、須田恭之客員研究員、石井みどり研修生(研究当時)、黒川量雄専任研究員、中野明彦チームリーダー(光量子工学研究センター副センター長)の研究チームは、生きた細胞内でトランスゴルジ網(TGN)^[1]のダイナミクスを詳細に観察し、TGNを通過する積荷タンパク質^[2]の入口と出口が時空間的に明瞭に区画化されていることを明らかにしました。

本研究成果は、細胞内タンパク質輸送・選別機構の破綻が原因となって起こるさまざまな疾患のメカニズム解明に貢献すると期待できます。

小胞体^[3]で新しく合成され、細胞膜や細胞外などに向けて運ばれる積荷タンパク質は、一旦ゴルジ体^[4]に取り込まれて修飾を受けた後、TGNへと受け渡されます。TGNは、積荷タンパク質を仕分けし、それぞれが働くべき細胞内区画へ送り出す、細胞内タンパク質輸送経路の“ハブ”として働きます。

今回、研究チームは、独自に開発した高速高感度レーザー共焦点顕微鏡システム(SCLIM)^[5]によって、酵母細胞におけるTGNの詳細な時空間ダイナミクスを観察しました。その結果、TGNは「積荷を受け取るステージ」から「積荷を運び出すステージ」へ、両者が空間的に区画化された状態を保ちつつ、徐々に遷移していくことが明らかになりました。また、「積荷を運び出すステージ」内において、それぞれの目的地に向けて積荷運び出しを実行する各種被覆・アダプタータンパク質^[6]が、独自の時空間ダイナミクスを呈することも明らかになりました。

本研究は、英国の科学雑誌『Journal of Cell Science』への掲載に先立ち、オンライン版(7月9日付)に掲載されました。

※研究支援

本研究は、日本学術振興会(JSPS)科学研究費補助金基盤研究S「ゴルジ体を中心とした選別輸送の超解像ライブイメージングによる完全解明(研究代表者:中野明彦)」、同基盤研究S「可視化による膜交通の分子機構の解明と植物高次システムへの展開(研究代表者:中野明彦)」、同新学術領域研究(研究領域提案型)「ER exit siteでのGPIアンカー蛋白質選別輸送ゾーンの解析(研究代表者:中野明彦)」、同新学術領域研究(研究領域提案型)「成長円錐のスクラップ&ビルドによる神経回路形成(研究代表者:戸島拓郎)」、同新学術領域研究(研究領域提案型)「神経回路形成・再生を担う成長円錐スクラップ&ビルドの可視化と操作(研究代表者:戸島拓郎)」、同基盤研究C「ゴルジ体カルシウムシグナルによる神経軸索ガイダンス(研究代表者:戸島拓郎)」、同基盤研究C「細胞内新規膜構造形成の分子メカニズム(研究代表者:須田恭之)」による支援を受けて行われました。

背景

全ての生物は膜で仕切られた細胞からできており、これが生命の基本単位として働いています。細胞の中には、膜で包まれたさまざまな種類の細胞小器官が存在しており、それぞれが独自の役割を果たすことで細胞の生命活動が維持されています。

細胞小器官の一つであるゴルジ体は、「槽」と呼ばれる膜でできた袋が複数積み重なった特徴的な構造をとり、小胞体で新しく作られた積荷タンパク質を受け取って糖鎖付加などの修飾を施す働きを担っています。ゴルジ体で修飾を受けた積荷タンパク質は、ゴルジ体に隣接したトランスゴルジ網(trans-Golgi network: TGN)と呼ばれる網目状の膜構造体に受け渡されます。TGNは、積荷タンパク質を仕分けし、それぞれの働くべき場所へ送り出す細胞内タンパク質輸送の“ハブ”として特化した役割を担っています。逆に、一度目的地に到達した積荷タンパク質を受け取る役割があることも知られています。

どのようにして積荷タンパク質がゴルジ体からTGNへ受け渡されるのかは長らく謎に包まれていましたが、中野明彦チームリーダーらはこれまでに、自ら開発した高速高感度レーザー共焦点顕微鏡システム(SCLIM)を用いて、ゴルジ体の最も外側の槽(トランス槽)が積荷タンパク質を持ったまま、徐々にその性質をTGNへと変化させること(槽成熟)を明らかにしました^注1-4)。

しかし、ゴルジ体から生まれたTGNが、その後どのような時空間ダイナミクスを呈し、最終的にどのような運命をたどるのか、その詳細な過程については不明のままでした。

注1)2006年5月15日プレスリリース「細胞小器官ゴルジ体の蛋白質輸送の大論争に決着」
注2)2013年11月5日プレスリリース「ゴルジ体内の蛋白質輸送を制御する分子機構の一端を解明」
注3)2016年9月2日プレスリリース「ゴルジ体槽成熟の分子機構を解明」
注4)2019年3月11日プレスリリース「タンパク質がゴルジ体内を輸送される仕組みが明らかに」

研究手法と成果

研究チームは、酵母細胞の中で働く2種類のゴルジ体常在タンパク質^[7](Sec21、Gnt1)および9種類のTGN常在タンパク質(Ypt6、Sys1、Tlg2、Sec7、Clc1、Apl2、Gga2、Apl6、Chs5)を異なる色の蛍光タンパク質で多重標識し、これらの詳細な時空間ダイナミクスを、高速高感度レーザー共焦点顕微鏡システム(SCLIM)によって観察しました。

TGN常在タンパク質は、積荷の受入れを担うグループ(Ypt6、Sys1、Tlg2)と、積荷の運び出しを担うグループ(Clc1、Apl2、Gga2、Chs5)に大別できます。単一の槽に着目して時系列観察を行った結果、ゴルジ体常在タンパク質が存在するステージ(ゴルジステージ)から、積荷の受入れを担うTGNタンパク質群が集積するステージ(初期TGNステージ)を経て、積荷の運び出しを担うTGNタンパク質群が集積するステージ(後期TGNステージ)へと徐々に移り変わっていく、槽成熟のダイナミクスが明らかになりました(図1)。

さらに、ステージ移行中の槽の内部の精密な空間情報を観察した結果、前後のステージの常在タンパク質は互いに混ざり合うことなく、明瞭に区画化された状態で単一の槽内に共存していることが明らかになりました(図2、図3)。

また、後期TGNステージにおける各常在タンパク質の動態を詳しく観察したところ、個々の被覆・アダプタータンパク質が独自の時空間ダイナミクスを呈することが明らかになりました。例えば、TGNからエンドソーム^[8]への積荷運び出しを担うクラスリン被覆(Clc1)は、TGN全体を覆いつくした後に網目状構造や多数の小胞となり、最終的に細胞質中に分散して消滅しました。一方、液胞への積荷運び出しを担うAP-3アダプター(Apl6)は、複数の小さな粒状構造として一定期間TGN表面に付着するダイナミクスを示し、Clc1のようにTGN全体を覆いつくすことはありませんでした。

以上の観察から、TGNが生まれてから消えるまでの、一連の詳細な時空間ダイナミクスが明らかになりました。特に重要なポイントとして、単一のTGN内において、「積荷を受け取るゾーン」と「積荷を運び出すゾーン」の二つの機能領域が時空間的に分離して存在していることが初めて明確に示されました。

今後の期待

過去の研究では、TGNとゴルジ体との境界線が明瞭に示されていなかったこともあり、TGNがゴルジ体を構成する槽の一つと誤認されることがしばしばありました。本研究は、ゴルジ体とは異なるTGNのアイデンティティを明確に示しました。また最近の研究では、植物細胞や酵母細胞のTGNが初期エンドソームとしての機能を持つことも明らかになっています。

今後は、TGNは細胞内タンパク質輸送のハブとしての機能に特化した、ゴルジ体からは完全に独立した細胞小器官である、という考え方が主流になっていくと予想されます。

積荷タンパク質の誤輸送は、さまざまな疾患の原因となることが知られています。今後のさらなる研究の発展により、TGNでの積荷選別輸送の分子メカニズムの全貌が明らかになれば、その破綻が原因となって起こる疾患に対する治療戦略の構築に大きく貢献できると考えられます。

原論文情報

Takuro Tojima, Yasuyuki Suda, Midori Ishii, Kazuo Kurokawa, and Akihiko Nakano, “Spatiotemporal dissection of the trans-Golgi network”, Journal of Cell Science, 10.1242/jcs.231159

発表者

理化学研究所
光量子工学研究センター 生細胞超解像イメージング研究チーム
研究員 戸島 拓郎(とじま たくろう)
客員研究員 須田 恭之(すだ やすゆき)
研修生(研究当時) 石井 みどり(いしい みどり)
専任研究員 黒川 量雄(くろかわ かずお)
チームリーダー 中野 明彦(なかの あきひこ)

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当

補足説明

1. トランスゴルジ網(TGN)

   小胞体からゴルジ体を経由して受け取った積荷タンパク質を仕分けし、さらに細胞内各所に向けて送り出す網目状の膜構造体。細胞膜などからリサイクルされた積荷タンパク質も取り込んで仕分けする。ゴルジ体の最も外側の槽(トランス槽)が成熟することによって形成される。

2. 積荷タンパク質

   小胞体で新規合成され、細胞内膜交通経路によって働く場所(細胞外、細胞膜、各種細胞小器官など)まで運ばれていく過程にある膜/分泌型タンパク質の総称。

3. 小胞体

   シート状またはチューブ状の膜からなる細胞小器官の一つ。リボソームが付着している粗面小胞体では、ゴルジ体に運ばれる積荷タンパク質の合成が行われる。

4. ゴルジ体

   19世紀にイタリアの神経科学者カミロ・ゴルジによって発見された細胞小器官で、タンパク質に糖鎖付加などの修飾を施す役割を持つ。扁平な膜で出来た袋(槽)からなり、多くの生物種では槽が多数積み重なった層板構造をとるが、出芽酵母細胞では、全ての槽がバラバラになって細胞内に散在する。

5. 高速高感度レーザー共焦点顕微鏡システム(SCLIM)

   研究チームが独自に開発した顕微鏡システム。スピニングディスク式共焦点スキャナー、高速駆動ピエゾ、多波長分光器、冷却イメージインテンシファイア―、EMCCDカメラ等から構成される。SCLIMは、Super-resolution Confocal Live Imaging Microscopyの略。

6. 被覆・アダプタータンパク質

   細胞膜の内側や細胞小器官の表面に付着し、輸送小胞の形成や積荷の選別に関わるタンパク質群。TGN上の被覆タンパク質としてはクラスリン、アダプタータンパク質としてはAP-1、AP-3などがあり、それぞれエンドソームや液胞といった異なる目的地への輸送を媒介する。

7. 常在タンパク質

   ゴルジ体やTGNの各槽に特異的かつ定常的に存在するタンパク質の総称。TGN常在タンパク質としては、クラスリン被覆タンパク質Clc1、アダプタータンパク質AP-1及びGGA、SNAREタンパク質Tlg2などが挙げられる。ゴルジ体常在タンパク質としては、糖鎖修飾酵素Gnt1、COPI被覆タンパク質Sec21などがある。

8. エンドソーム

   細胞小器官の一つ。細胞のエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた、物質の輸送や代謝に関与する袋状の構造体。

図1 SCLIMにより明らかになったTGNの形成と消失の時空間ダイナミクスのイメージ

TGNは、ゴルジ体(赤、Sec21、Gnt1が存在)が時間経過とともにその性質を徐々に変える「槽成熟」により形成される。本研究により、TGNは、積荷を受け入れる初期TGNステージ(緑、Ypt6、Sys1、Tlg2が存在)と、積荷を運び出す後期TGNステージ(青、Clc1、Apl2、Gga2、Chs5が存在)に分類できることが初めて明らかになった。ステージ移行期間中は、前後のステージ常在タンパク質は互いに混ざり合うことなく、区画化された状態で単一の槽内に共存していた。後期TGNは、最終的に多数の小胞となって細胞質中に分散して消滅した。

図2 ゴルジ体から初期TGNへの移行過程

SCLIMにより酵母細胞のゴルジ体(赤)が初期TGN(緑)に変化していく過程をタイムラプス観察した。単一の槽内で、ゴルジ体常在タンパク質Sec21(赤)が、徐々に初期TGN常在タンパク質Tlg2(緑)に入れ替わっていく様子を捉えた。ステージ移行期(拡大像)では、両者が完全に混ざり合うことなく区画化していた。

図3 初期TGNから後期TGNへの移行過程

SCLIMにより酵母細胞の初期TGN(緑)が後期TGN(赤)に変化していく過程をタイムラプス観察した。単一の槽内で、初期TGN常在タンパク質Tlg2(緑)が、徐々に後期TGN常在タンパク質Clc1(赤)に入れ替わっていく様子を捉えた。ステージ移行期(拡大像)では、両者が完全に混ざり合うことなく区画化していた。