エピゲノムの制御を受けた転写の方程式~エピゲノム異常の影響を反応素過程ごとに理解する~

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2020-11-26 理化学研究所,東京大学,東京工業大学,千葉大学

理化学研究所(理研)生命機能科学研究センターエピジェネティクス制御研究チームの梅原崇史チームリーダー、若森昌聡技師、東京大学大学院薬学系研究科の岡部弘基助教、東京工業大学情報理工学院の瀧ノ上正浩准教授、千葉大学大学院理学研究院の浦聖恵教授らの共同研究グループは、細胞の機能発揮に関わる「エピゲノム[1]」の化学修飾[2]が遺伝子の転写[3]に与える影響を、反応の素過程に分けて定量化する方程式を導出しました。

本研究成果は、がん細胞などで見られるエピゲノム異常が転写のどの反応素過程に影響するかの理解につながると期待できます。

エピゲノムは、ゲノムDNA中の遺伝子をRNAに転写する度合いを制御する、ゲノムDNAの可逆的な化学修飾の仕組みです。細胞核に収められたゲノムDNAはクロマチン[4]と呼ばれる凝縮した構造をとっており、エピゲノムは転写前にその凝縮を解きほぐすなど、クロマチン構造を変換する複数の反応素過程を制御します。エピゲノムを特徴づけるヒストン[5]の化学修飾には複数のパターンがありますが、それらが転写のどの素過程をどの程度制御するのかはよく分かっていませんでした。

今回、共同研究グループは、5SリボソームDNA(rDNA)[6]という短い遺伝子をクロマチンのモデルとして、生化学(作る)・生物物理学(測る)・数理解析(モデル)の異分野融合研究を行い、エピゲノムの制御を受けた転写の素過程ごとの反応速度を求める方程式を導出しました。その結果、今回の実験系では、ヒストンH4[5]のN末端テイルが最も高度にアセチル化された状態[7]における転写可能なクロマチンの形成速度は、全くアセチル化されていない状態と比べて2.9倍速いことを見いだしました。

本研究は、科学雑誌『Nucleic Acids Research』のオンライン版(11月26日付:日本時間11月26日)に掲載されます。

エピゲノム修飾が影響する転写反応素過程の理解の図

エピゲノム修飾が影響する転写反応素過程の理解

背景

「エピゲノム」は、ゲノムDNA中の遺伝子がRNAに転写される度合いを制御する、ゲノムDNAの可逆的な化学修飾の仕組みです。ヒトを含む真核生物の細胞核内では、ゲノムDNAはヒストンタンパク質に巻き付いたヌクレオソーム[8]という構造を単位として、たくさんのヌクレオソームがつながった「クロマチン」と呼ばれる凝縮体を作ります。クロマチン中のヒストンとDNAは、ゲノムの場所に応じてさまざまな化学修飾を受け、それらが総体として集積することでエピゲノムが作られます。

エピゲノムを特徴づける代表的な化学修飾は、ヒストンに対するアセチル化です。特に、ヒストンを形成する4種類のタンパク質のうち、ヒストンH4のN末端テイルのリシン残基がアセチル化を受けると、RNAポリメラーゼ[3]によるクロマチンからの遺伝子の転写が促進されます。この転写の促進は、アセチル化によって転写開始部位付近に位置するヌクレオソームのリモデリングや再配置が促進されることで起こると考えられていますが、そのメカニズムについては不明な点がまだ数多くあります。

細胞内のクロマチンにおいて、ヒストンH4のアセチル化のパターンには数多くの種類があります。そのうち、N末端から数えて5番目、8番目、12番目、16番目の4カ所のリシン残基(1文字略称はK)が同時にアセチル化された状態(4Kac修飾)は特に重要で、この4Kac修飾は転写が可能なクロマチン領域によく見られます。しかし、クロマチンからの転写は複数の段階的な「反応素過程」で構成されており、その各反応素過程における特定のエピゲノム修飾の貢献度を定量的に分析することは、これまで困難でした。それは、特定の化学修飾を含んだエピゲノムやクロマチンを試験管内で精密に再構成することが難しかったからです。

ヒトゲノムには約2万種類の遺伝子が含まれていますが、これらはRNAポリメラーゼI、II、IIIのいずれかのRNA合成酵素によって転写されます。遺伝子の中でも、RNAポリメラーゼIIIによって転写される5SリボソームDNA(5S rDNA)と呼ばれる遺伝子は、転写される塩基配列の長さが約120塩基と短く、遺伝子の本体部分にヌクレオソームを1個だけ含むクロマチンを作るという特徴があります。そのため、5S rDNAは、クロマチンを鋳型とする転写反応を試験管内で分析するモデル実験系として知られています。5S rDNA遺伝子を直列に二つ連結したジヌクレオソームDNAは、アセチル化されたヒストン8量体を用いて再構成した場合、転写可能な状態になります。しかし、試験管内で観察する転写反応は通常、標識されたリボヌクレオチド[3]を用いて転写したRNAを反応後に電気泳動で検出することが多く、その反応の量や進行度を経時的に測定することが困難です。このことも、クロマチンからの転写の素過程におけるエピゲノム修飾の貢献度の定量分析が難しかった理由です。

このような背景に基づき、共同研究グループは、特定のエピゲノム修飾が転写の制御に果たす貢献度を反応素過程ごとに定量的に理解するための方程式を導出することを目指しました。

研究手法と成果

共同研究グループはまず、クロマチンからの転写反応を経時的に測定するための鋳型となるDNAを設計しました。これは、5S rDNA遺伝子に外来遺伝子(c-fos)由来の塩基配列を挿入し、この遺伝子カセットを直列に二つ連結してジヌクレオソームDNAとするものです(図1A)。このジヌクレオソームDNAから転写されたRNAは、蛍光標識した外来遺伝子プローブを用いることで、蛍光相関分光法[9]により経時的な検出が可能になります。

次に、4カ所のリシン残基が同時にアセチル化されたヒストンH4(4Kac修飾H4)を得るため、遺伝暗号の拡張技術注1)を用いて、5番目、8番目、12番目、16番目のリシン残基をアセチルリシン残基に置き換えた組換えタンパク質を無細胞タンパク質合成技術[10]で作製しました。これに、他の3種類のコアヒストン(H2A、H2B、H3)と前述のジヌクレオソームDNAを合わせて、クロマチンを再構成しました(図1C)。さらに、4Kac修飾H4と比較するため、無修飾H4を含むジヌクレオソームも同様に再構成しました(図1B)。

そして、無修飾H4と4Kac修飾H4を含むジヌクレオソームで、DNAとヒストンの巻き付き状態に違いがあるかを調べるため、DNA消化酵素(エンドヌクレアーゼ)を用いた消化アッセイを行いました。この消化酵素は、ヒストンと巻き付いていない裸のDNAを消化しやすいことが知られていますが、消化アッセイではジヌクレオソームの消化パターンに両者の差は見られませんでした(図1D)。このことから、4Kac修飾H4は無修飾H4の状態と比べて、クロマチンを緩める反応素過程を促進しないことが確認できました。

注1)2015年5月18日プレスリリース「DNA情報の変換ルールを人為的に改変

クロマチンからの転写に用いる4Kac修飾ジヌクレオソームの再構成の図

図1 クロマチンからの転写に用いる4Kac修飾ジヌクレオソームの再構成

A)ジヌクレオソーム遺伝子カセットX5S197-F2の模式図。5SリボソームDNA(5S rDNA)遺伝子の転写産物を矢印で、その内部制御領域を四角(box A、IE、box C)で、蛍光相関分光測定のための20塩基の外来遺伝子(c-fos)由来のアンチセンスプローブの部分塩基配列を赤で示す。

B)無修飾ヒストンH4で再構成した5S rDNA遺伝子ジヌクレオソームの原子間力顕微鏡像。

C)4Kac修飾ヒストンH4で再構成した5S rDNA遺伝子ジヌクレオソームの原子間力顕微鏡像。

D)エンドヌクレアーゼ(MNase)を用いたジヌクレオソームの消化アッセイ。[無]のレーンは、無修飾H4を含むジヌクレオソームを消化したDNAの泳動、[4]のレーンは、4Kac修飾H4を含むジヌクレオソームを消化したDNAの電気泳動、「MNase」のヒストグラムは、1マイクログラムDNAあたりのMNase使用量を示す。MNaseで消化しないジヌクレオソームDNA(左から1番目と2番目のレーン)は、ヌクレオソーム2個分のDNAに相当する424塩基対(bp)のバンドが見られる。MNase量の増加に伴って、MNaseで消化されにくいヌクレオソームのDNAを示す145~147bpのバンドが蓄積し、その後減少していくが、その傾向は無修飾H4と4Kac修飾H4でほぼ同様である。これは、ヌクレオソーム構造によるMNase消化の阻害効果が等しく起きていることを示す。なお、本実験に用いたジヌクレオソームDNAはc-fos由来の配列を含まないため、(A)で示した配列よりやや短い。


次に、蛍光相関分光法を用いた経時的な転写反応の検出系を構築しました。試験管内での転写反応には、5S rDNAの転写に必要なRNAポリメラーゼIIIを含む転写装置が蓄積されているカエル卵母細胞核抽出物を用いました。この抽出液には、内在性の5S rDNAから転写された5s rRNAも多く含まれますが、本実験で用いたジヌクレオソームDNAはカエルゲノムに存在しない外来遺伝子由来の塩基配列を持つため、そのアンチセンスRNA[11]を蛍光プローブとして用いることで区別できます。検出の原理は、蛍光標識したアンチセンスRNAプローブがジヌクレオソームDNAから転写されたRNAとハイブリダイゼーション[12]すると、蛍光相関分光法によって観察される蛍光標識体の拡散速度が低下することを利用するものです(図2A, B)。検証実験では、c-fos由来塩基配列を含む5S rDNAを転写した場合でのみ、蛍光標識体の拡散速度が低下し(図2C)、さらに転写されたRNAの濃度と拡散速度の相関関係から、RNAの定量が可能であることが確認できました(図2D)。

このように経時的な転写反応の検出系を確立したことで、さまざまな状態のDNAからの転写がどのような速度で進むかを解析することが可能となりました。本実験では、裸のDNA(クロマチン構造をとらないDNA)、無修飾H4で再構成したクロマチン、4Kac修飾H4で再構成したクロマチンの3種類を鋳型として用いて、それぞれの転写データを取得しました(図2E)。

元素周期表の図

図1 元素周期表

A)蛍光標識アンチセンスRNAプローブとRNA転写産物とのハイブリダイゼーションの模式図。

B)転写されたRNAを検出するための蛍光相関分光法の模式図。転写産物とハイブリダイゼーションしたときのアンチセンスプローブの拡散時間の変化は、1分子レベルでアバランシェフォトダイオードにより検出した。

C)反応液中の蛍光自己相関関数。5S rDNA遺伝子の2直列コピーからT7 RNAポリメラーゼで末端開始RNAを転写し、鋳型DNAを含まないカエル卵母細胞核抽出液に添加した。丸はデータポイント、実線はフィッティング曲線を示す。挿入図は、アンチセンスプローブの平均拡散時間。赤で示したc-fos由来塩基配列を含む5S rDNAを転写した場合でのみ、蛍光標識体の拡散速度が低下した。

D)アンチセンスプローブ分子の濃度を関数とする平均拡散時間の検量線。5S rDNA遺伝子の2直列コピーからT7 RNAポリメラーゼで末端開始RNAを転写し、鋳型DNAを含まないカエル卵母細胞核抽出液に添加した。R2は決定係数を示す。これにより、RNAの定量が可能なことが分かった。

E)5S rRNAの経時検出。使用した鋳型DNAは、灰色:c-fos由来配列を含まない裸の5S rDNA遺伝子、黒色:c-fos由来配列を含む裸の5S rDNA遺伝子、赤色:c-fos由来配列を含む4Kac修飾ジヌクレオソーム5S rDNA遺伝子、青色:c-fos由来配列を含む無修飾ジヌクレオソーム5S rDNA遺伝子を示す。


得られた経時的な転写データをもとに、H4のアセチル化修飾の有無がクロマチンからの転写反応のどの素過程に影響するかを定量的に解析しました。この定量解析を行うため、クロマチンからの転写反応の単純化モデルを構築しました(図3)。このモデルでは、クロマチンからの転写が次の四つの素過程で構成されると仮定しました。

(Ⅰ)クロマチンアクセシビリティ
クロマチンへのタンパク質の接近可能性を評価する指標。エンドヌクレアーゼなどの酵素を用いて評価。

(Ⅱ)転写可能なクロマチンの形成
RNAポリメラーゼによる転写を可能にするための一連のクロマチン仲介反応をカバーする素過程。

(Ⅲ)転写前のプライミング
プロモーター[13]上における基本転写因子[14]やRNAポリメラーゼによる転写前開始複合体の段階的な分子集合の素過程。

(Ⅳ)RNAポリメラーゼによる転写
RNAポリメラーゼによる転写の素過程。

このモデルでは、裸のDNAからの転写反応は素過程(III)と(IV)で構成され、クロマチンからの転写反応は素過程(I)から(IV)によって段階的に構成されていきます。

クロマチンからの転写を反応素過程に分けて記述した単純化モデルの図

図3 クロマチンからの転写を反応素過程に分けて記述した単純化モデル

(I)から(II)への進行は、生体内ではエピゲノムを認識し、クロマチンを再構成するクロマチンリモデリング因子などが関わる。こうして転写可能になったクロマチンには、RNAポリメラーゼIII(RNA Pol III)と基本転写因子群(TFIIIA、TFIIIB、TFIIIC)が結合し(III)、RNAポリメラーゼによる転写が始まる(IV)。

次に、クロマチンからの転写反応の単純化モデルと蛍光相関分光法で得られた転写データに基づいて、転写反応の各素過程の速度論モデルを構築し、転写データを定量化しました。鋳型のDNAや転写産物のRNAの濃度変動を記述する方程式を構築し(図4A)、クロマチンからの転写量Zξと裸のDNAからの転写量Z裸のDNAは、それぞれ図4Bと図4Cの方程式で記述できることを導きました。これらの方程式では、転写反応はミカエリス・メンテン式[15]型の酵素反応を仮定し、Zは、反応時刻tにおけるクロマチンまたは裸のDNAからの転写量を示すtの関数となります。

クロマチンからの転写反応の速度論モデルの図

図4 クロマチンからの転写反応の速度論モデル

A)クロマチンからの転写反応のモデル化の説明。ξは、c-fos由来のアニーリング配列を含むクロマチンテンプレートの種類(4Kac修飾または無修飾のクロマチン)、Cは鋳型の濃度、αξはクロマチン’ξ’のアクセシビリティ、kξはクロマチン’ξ’の転写可能なクロマチンの形成速度、kはプライミング速度、kcatはRNAポリメラーゼIIIのターンオーバー数、Kmはミカエリス・メンテン定数、CRPはRNAポリメラーゼIIIの濃度を表す。

B)クロマチンからの転写反応の速度論。γは転写速度、tは反応時刻を表す。

C)裸のDNAからの転写反応の速度論。

これらの方程式を用いて、素過程(I)から(IV)までのクロマチンからの転写反応の反応速度論をシミュレーションした結果、(II)の転写可能なクロマチンの形成速度kξは、転写量の最終的な増加速度ではなく、転写が始まるまでの時間の遅延に影響することを確認しました。一方、(I)のアクセシビリティαξは、転写が始まるまでの時間の遅延ではなく、転写量の最終的な増加速度に影響することを確認しました。

そこで、今回得られた転写データをこの速度論モデルに当てはめることにより、クロマチンからの転写を制御する速度論パラメータを推定しました。まず、裸のDNAの転写データを速度論の方程式に当てはめ、転写速度γが毎分0.052ナノモル濃度(nM、1nMは10億分の1モーラー)、およびプライミング速度kpが毎分0.22であることを算出しました(図5A)。

次に、これらの値を用いて、クロマチンからの転写反応の速度論を推定しました。図1Dのエンドヌクレアーゼの消化データに基づき、クロマチンに対するアクセシビリティαξをアセチル化状態によらず1と仮定して、4Kac修飾および無修飾クロマチンの転写データをフィッティングした結果、転写可能なクロマチンの形成速度kξは、4Kac修飾クロマチンの場合は毎分約0.15、無修飾クロマチンの場合は毎分約0.052の値が得られました(図5B)。このフィッティングの全ての解析で、決定係数[16]は十分に大きい値(≧0.91)でした。

以上の結果から、本研究で構築した反応速度論モデルがクロマチンからの転写反応を妥当に記述できることが示されました。最終的に、今回の方程式と転写データを用いた速度論分析により、4Kac修飾状態における転写可能なクロマチンの形成速度は、アセチル化が全くない状態と比較して2.9±0.4倍速いことが分かりました(図5C)。

速度論モデルへのフィッティング解析の図

図5 速度論モデルへのフィッティング解析

A)転写速度γ値とプライミング速度kp値の決定。γ値は裸のDNAの実験データの線形領域(12~17分)を速度論モデルZ裸のDNA=γt+z1にフィッティングして決定した(z1は切片を示す)。フィット値はγ=0.052±0.003nM/分、z1=-0.23±0.05nMであった。得られたγを用いてデータの全領域(0~17分)を速度論モデルZ裸のDNA=γ[t-(1-ekpt)/kp]+z2でフィットした。z2は初期段階での実験誤差を解消するために導入された切片を示す。フィット値はkp=0.22±0.01/分、z2=-0.010±0.01nMであった。

B)転写可能なクロマチンの形成速度kξ値の決定。各DNA状態におけるフィッティング結果。Zξは転写産物の濃度であり、ξは4Kac修飾、無修飾、または裸のDNAを示す。(A)で得られた値をフィッティング解析に用いた。4Kac修飾クロマチンのkξは0.15±0.009/分、無修飾クロマチンのkξは0.052±0.006/分だった。

C)4Kac修飾によるクロマチンからの転写促進の模式図。Bの結果から、4Kac修飾の状態は、無修飾の状態と比べて転写可能なクロマチンの形成速度kξが2.9±0.4倍速いことが判明した。

今後の期待

本研究で定式化したエピゲノム転写の方程式は、ヒストンのアセチル化修飾の意義の定量的な理解に留まらず、ヒストンやDNAに対するアセチル化以外の化学修飾やその組合せの分析にも広く適用できます。また、細胞の核内においてエピゲノムを鋳型として起こる生体内現象には、転写以外にエピゲノムの複製や修復などがあります。今後、これらの現象においてもそれぞれの反応素過程におけるエピゲノム修飾の貢献度を定量的に分析する研究に応用できると考えられます。

なお、今回再構成した4Kac修飾のクロマチンは、ヒストンH4の5番目と8番目のリシン残基の同時アセチル化修飾を含みます。この同時アセチル化状態は、がん遺伝子の発現を活性化し、アセチル化修飾に結合するタンパク質を阻害する薬剤に対して抵抗性を示すことが分かっています注2)。がん細胞などで見られるエピゲノムの異常を理解する上でも、エピゲノム修飾がクロマチンからの転写の反応素過程の速度に与える影響を定量化する方程式は重要なツールになると期待できます。

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