体の左右非対称性はmRNAの分解から始まる

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左向きの水流に応答したRNA結合タンパク質と分解酵素の働き

2021-07-30 理化学研究所,スイス連邦工科大学,京都大学iPS細胞研究所

理化学研究所(理研)生命機能科学研究センター個体パターニング研究チームの濱田博司チームリーダー、峰岸かつら研究員(研究当時、現客員研究員)、スイス連邦工科大学ローザンヌ校のダニエル B. コンスタム教授、京都大学iPS細胞研究所(CiRA)の齊藤博英教授、小松リチャード馨大学院生(研究当時)らの国際共同研究グループは、動物の体の左右非対称性を決定する仕組みにおいて、初期胚が生み出す体液の流れに応答して、体の左側だけでメッセンジャーRNA(mRNA)[1]が分解されるメカニズムを解明しました。

内臓の形や配置など、私たちの体内構造に見られる左右非対称性は、胚発生の初期に現れる「ノード[2]」と呼ばれる凹んだ組織で決定されます。ノード中心部の細胞群には、時計回りに回転する繊毛[3]が存在し、ノード内に左向きの水流を作り出す結果、ノード周縁部の左右両側で発現していたDand5遺伝子[4]のmRNA(Dand5 mRNA)が左側特異的に分解されます。これにより、水流という機械的刺激が左右非対称な遺伝子発現へと変換されます。しかし、どのような機構で水流依存的にDand5 mRNAが分解されるかは不明でした。

今回、国際共同研究グループは、トランスジェニックマウス[5]胚を用いて、Dand5 mRNAの分解を可視化する実験系を確立しました。解析の結果、Dand5 mRNAの3’非翻訳領域(3′-UTR)[1]内に進化的に保存されたGACに富む配列モチーフが存在し、RNA結合タンパク質Bicc1がこれを特異的に認識してmRNA分解酵素Ccr4-Not複合体を呼び込み、Dand5 mRNAが分解されることが明らかになりました。

本研究は、科学雑誌『Nature Communications』(2021年7月1日付)に掲載されました。

Dand5 mRNAの左側特異的な分解(左)は、3′-UTRに欠損が生じると観察されなくなる

背景

ヒトやマウスなどの哺乳類は、外観は左右対称のように見えますが、心臓や肺、肝臓など、ほとんどの臓器の形や配置は左右非対称です。この左右非対称性は、発生の段階で初期胚(マウスの場合、受精後7.5日)の腹側に一時的に形成される「ノード」と呼ばれる凹んだ組織において決まります。

ノードの細胞には、動く繊毛と動かない繊毛の2種類が存在しています。動く繊毛はノード中心部の細胞群に存在し、時計回りに回転して周りの体液を動かすことで、ノード内に左向きの水流を作り出します。一方、動かない繊毛はノードの脇に位置する細胞群(クラウン細胞)に存在し、水流を感知するとカルシウムチャネル[6]を開いて繊毛内にカルシウムイオン(カルシウム)を流入させます(図1)。

クラウン細胞は左右対称に分布していますが、左向きの水流はノード左側のクラウン細胞の繊毛で感知されます。この結果、ノード周縁部の左右両側で発現していたDand5と呼ばれる遺伝子のメッセンジャーRNA(Dand5 mRNA)が、ノードの左側で特異的に分解されます。この左側特異的なmRNAの分解により、水流という機械的刺激が左右非対称な遺伝子発現へと変換される仕組みと考えられています。しかし、どのような機構で水流依存的にDand5 mRNAが分解されるかは不明のままでした。

マウス初期胚におけるノードの構造と水流の発生の仕組みの図

図1 マウス初期胚におけるノードの構造と水流の発生の仕組み

(A)マウス受精後8日目胚を左側面からみた電子顕微鏡写真
スケールバーは100マイクロメートル(μm、1μmは1,000分の1mm)。
(B)ノードを腹側から捉えた電子顕微鏡写真。スケールバーは10μm。
(C)ノードにおける繊毛の電子顕微鏡写真。スケールバーは1μm。
(D)ノードにおける左右非対称なDand5 mRNAのパターン。
(E)ノードには、動く繊毛と動かない繊毛の2種類が存在する。ノード中央の細胞の繊毛が斜めに回転運動をすることで、周りの体液を左方向へ動かし、水流を発生させる。この流れは、ノード周縁部のクラウン細胞の動かない繊毛により感知される。

※出典)Shiratori, H.; Hamada, H. The left-right axis in the mouse: From origin to morphology. Development 133, 2095-2104 (2006).


mRNAには、タンパク質をコードする配列のほかに、mRNAの翻訳効率や安定性に影響する非翻訳領域(UTR)という配列が5’末端側や3’末端側に存在します。過去の報告から、左右非対称なDand5 mRNAの局在にはDand5の3’末端側非翻訳領域(3′-UTR)が必要であることが知られていました。国際共同研究グループは、Dand5 mRNAの3′-UTRが左右非対称なmRNAの分解を誘導していると考え、ノードでのDand5 mRNAの分解の有無を可視化する実験系を確立して解析しました。

研究手法と成果

国際共同研究グループはまず、マウス初期胚でのDand5 mRNA分解を蛍光顕微鏡で観察するため、蛍光タンパク質の一種destabilized Venus (dsVenus)[7]の遺伝子配列とDand5 3′-UTRの遺伝子配列が融合した組換え遺伝子を構築しました。これにより、蛍光タンパク質の発現を通じて、Dand5 mRNAの分解の有無を可視化できます。この組換え遺伝子を導入したトランスジェニックマウス胚を作製し、野生型マウスや、左右性に表現型が現れるいくつかの変異体で、クラウン細胞における左右非対称なDand5 mRNAの分解パターンがどのように変化するかを検証しました。

このトランスジェニックマウス胚は、Dand5 mRNAの3′-UTR依存的な分解が起きた場合にのみ、蛍光タンパク質の発現が減少するという設計になっています。野生型トランスジェニックマウスの初期胚では、発生段階の初期では蛍光が左右対称に観察されましたが、発生が進み内在性のDand5 mRNAの左右非対称性が始まる時期になると、左側の蛍光が著しく減少しました(図2A)。これにより、Dand5 mRNAの3′-UTRがノードの左側のmRNAの分解を誘導するに十分であることが示されました。

次に、このmRNAの分解がノードにおける水流によって制御されているかどうかを調べるために、繊毛の機能異常のためノードでの水流が生じないiv/iv変異体[8]トランスジェニックマウス胚での蛍光パターンを観察しました。すると、蛍光は全ての胚で左右対称に観察されました。これらの結果から、マウスの初期胚では、ノードにおける水流刺激がDand5 mRNAの3′-UTR依存的にmRNAの分解を誘導することが明らかになりました。(図2B)。

蛍光タンパク質の配列とDand5 mRNA の3'-UTRを融合したmRNAを発現するトランスジェニックマウス胚の図

図2 蛍光タンパク質の配列とDand5 mRNA の3′-UTRを融合したmRNAを発現するトランスジェニックマウス胚

(A)トランスジェニックマウス胚の作製に用いた組換え遺伝子の模式図。クラウン細胞での発現に必要な配列(4NDE)と転写開始に必要な配列(Hsp promoter)の下流に、蛍光タンパク質ds Venusのコード領域と、Dand5の3’非翻訳領域(3′-UTR)を融合させた。dsVenusは、蛍光タンパク質Venusの不安定な変異体(destabilized Venus)であり、mRNAが分解されると、速やかに蛍光も減衰する。

(B)水流を生じないiv/iv変異体でのdsVenusの蛍光パターン。iv変異は潜性であるため、ヘテロ変異体(iv/+)でのパターンは野生型と変わらないが(左)、ホモ変異体(iv/iv)では左右対称になった(右)。スケールバーは50μm。


次に、水流刺激を細胞内に伝える役割を担うとされるカルシウムチャネルが、3′-UTR依存的なmRNAの分解に関与しているかを調べました。水流による刺激はノードの動かない繊毛で感知され、その繊毛に発現しているカルシウムチャネルが水流刺激依存的にカルシウムの細胞内への流入をもたらし、このカルシウムの流入が細胞内にシグナルを伝えていると考えられています。そこで、カルシウムチャネルが機能しない変異体でトランスジェニックマウス胚を作製したところ、ノードの左右において左右対称な蛍光が観察されました。これにより、Dand5 mRNAの3′-UTRはカルシウムチャネルを介して水流に反応していることが示されました。

上記の結果から、Dand5 mRNAの3′-UTRが水流依存的なmRNAの分解に十分であることが分かりました。3′-UTRは約1,200塩基もある長大な配列ですが、この中のどの配列が重要かをさらに詳しく調べるため、まず、さまざまな哺乳類のDand5遺伝子間で3′-UTRに相当するDNA配列を比較しました。その結果、5’末端から200塩基の領域が進化的によく保存されていることが分かりました。この配列が左右非対称な遺伝子発現に必要かどうかを調べるために、3′-UTRからこの領域を削除した配列を用いたトランスジェニックマウス胚を作製しました。このマウスの初期胚では、左右対称な蛍光パターンが得られたことから、Dand5 3′-UTRの5’末端から200塩基の領域が水流依存的なDand5 mRNAの分解に重要であることが示唆されました。

次に、Dand5遺伝子からこの200塩基の領域のみを欠損させた部分的な遺伝子欠損マウスを作製し、その左右非対称性への影響を検証しました。野生型の胚では発生過程において、Nodal[9]と呼ばれる遺伝子が左側の側板中胚葉[10]に特異的に発現します。ところが200塩基欠損マウス胚では、この発現が左右両方で消失していました(図3)。このことから、この200塩基がDand5 mRNAの水流依存的な左側での分解を通じて、下流の左右非対称な遺伝子発現をもたらしていることが確認できました。

Dand5 mRNA 3'-UTRの5'末端200塩基に依存するNodal遺伝子の左側特異的な発現の図

図3 Dand5 mRNA 3′-UTRの5’末端200塩基に依存するNodal遺伝子の左側特異的な発現

Nodal mRNAは、ノードでは左右対照に発現するが、側板中胚葉(LPM)では左側のみに発現する。Dand5 3′-UTR の5’末端200塩基の領域を欠損させたDand5Δ200prox/ Δ200proxマウス胚では、左側LPMのNodal mRNAの発現は消失した。

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