光合成色素を使って近赤外蛍光タンパク質を明るくすることに成功

ad

2021-12-21 基礎生物学研究所,生命創成探究センター

細胞内でタンパク質がどのように働いているのかを調べる方法として、目的のタンパク質に蛍光タンパク質を融合させてその蛍光を観察する手法が広く用いられています。これまでに様々な色の蛍光タンパク質が開発されてきました。その中でも最も長波長で働くものが近赤外蛍光タンパク質iRFPです。長波長帯の蛍光タンパク質は他の波長の蛍光タンパク質との同時多色イメージングに利用できる上、長波長帯の励起光や蛍光は生体深部透過性に優れているなどの利点があります。しかし、iRFPは他の蛍光タンパク質と違い、蛍光を発するためにビリベルジンという色素を必要とします。したがって、代謝によりビリベルジンを合成できない細胞種ではiRFPを用いた蛍光イメージングが利用できないという問題がありました。
今回、基礎生物学研究所 定量生物学研究部門/生命創成探究センター 定量生物学研究グループの酒井啓一郎大学院生、後藤祐平助教、近藤洋平助教、青木一洋教授らは、東京大学の神谷真子准教授のグループとの共同研究により、iRFPの発色団として、今まで知られていたビリベルジンだけではなく、光合成色素として知られるフィコシアノビリンが使用できることを新たに発見しました。また、ビリベルジンよりもフィコシアノビリンを用いた方が、iRFPの蛍光が明るくなることがわかりました。さらに、ビリベルジンやフィコシアノビリンを代謝により合成することができない分裂酵母細胞においても、それらの色素の合成酵素を発現させることでiRFPの蛍光強度を増強させることに成功しました。
本成果は、英国の学術誌「Journal of Cell Science」に2021年12月16日付けで発表されました。

【研究の背景】
細胞内で働いているタンパク質を可視化する技術は今日の生命科学には欠かせないものとなっています。2008年にノーベル賞を受賞した下村脩先生がオワンクラゲから発見した緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescence Protein, GFP)を始めとして、様々な蛍光タンパク質がこれまでに開発されています。蛍光タンパク質を目的のタンパク質へと融合することで、そのタンパク質が細胞内でどのように働くのかを蛍光で観察することができます。異なる蛍光波長特性をもつ複数の蛍光タンパク質を組み合わせることで、複数のタンパク質を同時に可視化する多重蛍光イメージングも近年重要な技術となってきています。蛍光タンパク質のうち最も長波長の蛍光特性を持つ近赤外蛍光タンパク質iRFPは、他の色の蛍光タンパク質と組み合わせた多重蛍光イメージングや近赤外光の生体深部透過性を活かした生体内(in vivo)イメージングなどに必須の蛍光タンパク質です。
GFPなどの一般的な蛍光タンパク質は、発色団と呼ばれる、光を受容し蛍光を発するための構造をタンパク質内部に自発的に作ることができるため、細胞にGFPを発現させるだけで蛍光を発します(図1A)。しかし、iRFPはGFPなどの蛍光タンパク質とは異なり、ビリベルジンと呼ばれる化合物を取り入れて発色団とします(図1B)。ビリベルジンは多くの生物種で代謝によって合成されますが、その保有量がiRFPの蛍光に十分であるかは生物種や細胞種によって異なります。また代謝によりビリベルジンを合成できない生物や細胞では、原理的にはiRFPを蛍光タンパク質として利用することができません。研究グループは、分裂酵母というシンプルな単細胞真核モデル生物の生命現象を可視化するためにiRFPを使おうとしたところ、偶然にもiRFPの蛍光が観察できなかったことを発見し、何故分裂酵母の細胞内ではiRFPが光らないのか、どうやったら光るようになるのかを知るためにこの研究をスタートしました。
光合成色素を使って近赤外蛍光タンパク質を明るくすることに成功図1. 蛍光タンパク質の発色のしくみ。(A)GFPは自発的に発色団を形成し蛍光を発する。(B)iRFPはビリベルジンを取り込み発色団を形成し、蛍光を発する。

【研究の成果】
本研究グループは、単細胞真核モデル生物の一つである分裂酵母において、iRFPが全く蛍光を発しないことを偶然にも発見しました(図2A左)。この分裂酵母細胞に外からビリベルジンを添加したところ、iRFPの蛍光が観察されました。このことから分裂酵母の細胞内ではビリベルジンが合成されていないためにiRFPが蛍光を発しなかったことが分かりました(図2A右)。分裂酵母がビリベルジンを合成するための遺伝子を持っていないのではないかと考え、ゲノム情報を検索し、ビリベルジンの合成に必要なヘムオキシゲナーゼ (Heme Oxygenase, HO) 遺伝子の有無を調べました。その結果、予想通り分裂酵母ではこの遺伝子は見つかりませんでした(図2B)。面白いことに、HO遺伝子は分裂酵母が属する菌類において、散発的に失われていることがわかりました。
fig2.jpg図2. 分裂酵母はビリベルジンを合成できないためiRFPが蛍光を発しない。
(A)分裂酵母にiRFPを発現させても蛍光は観察できないが(左)、外からビリベルジンを加えると蛍光が観察されるようになる(右)。(B)ビリベルジンを合成する酵素(HO)の遺伝子は真菌類内で散発的に失われている。


ビリベルジンを分裂酵母細胞に加える実験の過程で、ビリベルジンの類縁体であるフィコシアノビリンを添加したところ、iRFPの蛍光輝度が増強されることを偶然発見しました(図3)。フィコシアノビリンはシアノバクテリアなどの藻類が合成する光合成色素の一種です。フィコシアノビリンはビリベルジンを材料に合成され、光受容タンパク質と結合し太陽光エネルギーを吸収・伝達する役割があります。分裂酵母に精製したフィコシアノビリンを添加したところ、ビリベルジン添加時と比較してiRFPの蛍光強度が増強しました。組換えタンパク質を用いた試験管内(in vitro)の実験から、この蛍光の増強は、iRFP自体の明るさの増加、フィコシアノビリンの細胞への浸透しやすさ、蛍光波長の変化によって起こっていることが分かりました。
fig3.jpg

図3. 分裂酵母において、フィコシアノビリンはビリベルジンよりもiRFPの蛍光輝度を上昇させることができる。


フィコシアノビリンを用いたiRFPの蛍光イメージングをより利用しやすくするために、細胞内でフィコシアノビリンを人工的に合成できるシステムを導入しました。研究グループは以前にフィトクロームを用いた光遺伝学技術のために遺伝子導入により哺乳類細胞でフィコシアノビリンを合成するシステム「SynPCB」を開発していました(Uda, ACS Chem Biol, 2020)。そこで、試しにSynPCBを分裂酵母に導入してみたところ、期待通り分裂酵母内でフィコシアノビリンが合成され、その結果として高輝度のiRFP蛍光が安定して観察されることが分かりました(図4)。
fig4.jpg

図4. SynPCBシステムは外からの発色団の添加無しに、iRFPの蛍光輝度を上昇させることができる。

SynPCBシステムによるフィコシアノビリン細胞内合成を利用し、iRFPと他の4種の蛍光タンパク質を用いて、生きた分裂酵母細胞で5種類のタンパク質の局在を同時に可視化しました(図5)。これまで分裂酵母では多重蛍光イメージングは3~4色が限界でしたが、今回iRFPの高輝度化に成功したことで、多重蛍光イメージングの選択肢が広がりました。
fig5.jpg

図5. iRFPを利用した分裂酵母での5色多重蛍光生細胞イメージング

最後に、分裂酵母と同じくシンプルな真核モデル生物としてよく使われている出芽酵母においてもフィコシアノビリンによるiRFP蛍光の増強が可能かどうかを検証しました。出芽酵母は分裂酵母とは異なりビリベルジンを合成するHO遺伝子を持っているため、iRFPを発現させるだけでiRFPの蛍光が観察されました。しかし、フィコシアノビリンを添加したところ、iRFP蛍光強度は10倍程度明るくなりました(図6)。これは、出芽酵母細胞内のビリベルジン生産量が十分でないことと、フィコシアノビリンによるiRFP蛍光強度増加で説明できます。これまで発現量の低さにより明るさが不十分で観察することのできなかったタンパク質も、フィコシアノビリン添加によって出芽酵母で近赤外光イメージングに適応できる可能性を示しました。
fig6.jpg

図6. 出芽酵母でもフィコシアノビリンはiRFPを明るくすることができる。

【本研究の課題と今後の展望】
本研究では、シンプルな真核モデル生物である分裂酵母、出芽酵母においてフィコシアノビリンによりiRFPの蛍光輝度が増強されることを示しました。しかし、哺乳類培養細胞を用いた実験ではフィコシアノビリンによるiRFPの蛍光増強は僅かでした。これは、哺乳類細胞内ではビリベルジンやフィコシアノビリンが代謝されること、また培地の血清の中に含まれるビリベルジンやその類縁体による影響などが考えられます。将来的に、動物個体等で本研究の手法を適用する際には、組織や細胞種におけるビリベルジンやフィコシアノビリンの代謝を注意深く考慮する必要があることを示唆しています。
近赤外光は生体深部透過性が高く、動物個体内の深場での蛍光イメージングを可能とします。本研究でのフィコシアノビリンによるiRFP蛍光の増強は、生体深部イメージングのS/N比を向上させ、医療やバイオテクノロジーへの応用も期待されます。

【発表雑誌】
雑誌名 Journal of Cell Science
掲載日 2021年12月16日
論文タイトル: Near-infrared imaging in fission yeast using a genetically encoded phycocyanobilin biosynthesis system
著者: Keiichiro Sakai, Yohei Kondo, Hiroyoshi Fujioka, Mako Kamiya, Kazuhiro Aoki, and Yuhei Goto
DOI: https://doi.org/10.1242/jcs.259315

【研究グループ】
本研究は、基礎生物学研究所/生命創成探究センターの青木 一洋教授ら、東京大学薬学部神谷真子准教授らによる共同研究グループの成果です。

【研究サポート】
本研究は、科学技術振興機構CREST(JPMJCR1654)、および文部科学省日本学術振興会科学研究費助成事業(18H02444、19H05798、19K16050)の支援のもと行われました。

【本研究に関するお問い合わせ先】
基礎生物学研究所 定量生物学研究部門
生命創成探究センター 定量生物学研究グループ
教授 青木 一洋 (アオキ カズヒロ)

【報道担当】
基礎生物学研究所 広報室
自然科学研究機構 生命創成探究センター 研究連携推進室

有機化学・薬学
ad
ad
Follow
ad
タイトルとURLをコピーしました