水溶性化合物による組織透明化の化学~包括的ケミカルプロファイリングに基づく化学的原理の体系化~

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2018-08-22 理化学研究所,東京大学,新潟大学,日本医療研究開発機構

理化学研究所(理研)生命機能科学研究センター合成生物学チームの上田泰己チームリーダー(東京大学大学院医学系研究科機能生物学専攻システムズ薬理学教授)、新潟大学脳研究所システム脳病態学分野の田井中一貴特任教授、東京大学大学院医学系研究科機能生物学専攻システムズ薬理学の村上達哉日本学術振興会特別研究員らの共同研究グループは、水溶性化合物を用いた組織透明化の化学的原理の体系化に向けて、求められる透明化パラメータ(脱脂・脱色・屈折率調整・脱灰)[1]の包括的なプロファイリングに基づいた合理的手法を開発しました。
本研究成果により、ヒト臓器全細胞解析に向けて、従来の偶発的発見に依存した透明化試薬の開発戦略から、化学的原理に基づく合理的な開発戦略へのパラダイムシフトが期待できます。
今回、共同研究グループは、それぞれのパラメータに対して約1,600種類の水溶性化合物の「包括的なケミカルプロファイリング」を実施しました。その結果、①脱脂には塩を含まないオクタノール/水分配係数(logP)[2]の高いアミン(脂溶性アミンおよびアミノアルコールなど)が効果的であること、②脱色にはN-アルキルイミダゾールが効果的であること、③屈折率調整には芳香族アミドが効果的であること、④脱灰にはリン酸カルシウムのリン酸イオンのプロトン化(水素付加)が重要であることを見いだしました。さらに、各パラメータにおいて最適化されたケミカルカクテルを統合した一連の新しい「CUBIC[3]」プロトコール(手順)を開発することで、マウスの各種臓器および骨を含むマウス全身、ヒト組織を含む大きな霊長類サンプルの高度な透明化に成功しました。
本研究は、米国の科学雑誌『Cell Reports』オンライン版(8月21日付け:日本時間8月22日)に掲載されます。

図 マウス全脳遺伝子発現状況の一細胞解像度の比較観察

※共同研究グループ

理化学研究所 生命機能科学研究センター
合成生物学チーム
チームリーダー 上田 泰己(うえだ ひろき)
(東京大学大学院 医学系研究科 機能生物学専攻 システムズ薬理学 教授)
無細胞タンパク質合成研究ユニット
ユニットリーダー 清水 義宏(しみず よしひろ)
新潟大学 脳研究所
システム脳病態学分野
特任教授 田井中 一貴(たいなか かずき)
病理学分野
教授 柿田 明美(かきた あきよし)
動物資源開発研究分野
教授 笹岡 俊邦(ささおか としくに)
東京大学大学院 医学系研究科
機能生物学専攻 システムズ薬理学
日本学術振興会特別研究員 村上 達哉(むらかみ たつや)
病因・病理学専攻 人体病理学・病理診断学
教授 深山 正久(ふかやま まさし)
病因・病理学専攻 分子病理学
教授 宮園 浩平(みやぞの こうへい)
疾患生命工学センター 構造生理学部門
教授 河西 春郎(かさい はるお)
京都大学大学院 医学研究科 医学専攻 高次脳科学講座 神経生物学
教授 伊佐 正(いさ ただし)
大阪大学大学院 医学系研究科 病態病理学講座
教授 森井 英一(もりい えいいち)
福島県立医科大学 生体情報伝達研究所 生体機能研究部門
教授 小林 和人(こばやし かずと)
日本大学 医学部 細胞分子薬理学部門
特任教授 飯野 正光(いいの まさみつ)
慶應義塾大学 医学部 精神・神経科学教室
教授 田中 謙二(たなか けんじ)
北海道大学 遺伝子病制御研究所・大学院医学研究科 分子神経免疫学分野
教授 村上 正晃(むらかみ まさあき)
群馬大学 生体調節研究所 脳病態制御分野
教授 林(高木)朗子(はやし(たかぎ)あきこ)

※研究支援

本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)「革新的技術による脳機能ネットワーク全容解明プロジェクト」、「革新的バイオ医薬品創出基盤技術開発事業」、「革新的先端研究開発支援事業(AMED-CREST)」、「感染症研究革新イニシアティブ(J-PRIDE)」、および日本学術振興会(JSPS)「世界トップレベル研究拠点プログラム(WPI)」、科学研究費補助金基盤研究S「哺乳類生体リズム振動体の設計(研究代表者:上田泰己)」、基盤研究B「ヒト脳組織特異的染色による先進的3D神経病理学の確立(研究代表者:田井中一貴)」、新学術領域研究(研究領域提案型)「3D免疫染色によるタンパク質の老化基盤の解析(研究代表者:田井中一貴)」、民間研究助成(公益財団法人内藤記念科学振興財団、公益財団法人細胞科学研究財団、公益財団法人東京生化学研究会、公益財団法人ノバルティス科学振興財団)などの支援を受けて行われました。

背景

19世紀後半にドイツの解剖学者であるヴェルナー・シュパルテホルツが世界で初めて組織透明化技術の開発に着手して以来、さまざまな有機溶剤(例:欧州のBABB法、DISCO法)による透明化技術が開発されました。また、水溶性化合物による透明化試薬の開発にも長い歴史があり、1990年代にロシアのヴァレリー・ツーチンらによって糖やX線造影剤などが用いられた後、近年さまざまな透明化技術(例:日本のScale法、SeeDB法、CUBIC法、米国のCLARITY法)が開発されました。
これまでに生物の組織を透明化するために、どのような光学的性質(光の散乱、屈折、吸収)を実現すればよいかという物理学的な理論体系は確立されました。しかし、開発されたさまざまな透明化試薬がどのような原理で組織の透明化に寄与するのか、組織を透明化するのに求められる重要な化学的性質は何かといった単純かつ根本的な化学的疑問に答えることはできていませんでした。
これは、従来の透明化技術の開発戦略が、偶発的な発見および小規模な化合物群の場当たり的な組み合わせによる最適化に依存しており、化学種の多様性を網羅できていないこと、個々の化合物が持つ固有の化学的性質が考慮されていないことに起因しています。今後、生物学・医学における究極の課題であるヒト臓器全細胞解析に向けて、組織透明化技術がさらなる飛躍・発展を遂げるためには、学術的に確かな化学的理論の構築に資する、包括的アプローチに基づく開発戦略が望まれていました。

研究手法と成果

共同研究グループは、安全性を考慮して有機溶剤ではなく水溶性化合物に着目し、ハイスループットなスクリーニング系に基づく「包括的ケミカルプロファイリング」を考案しました(図1)。上田チームリーダーらが2014年に発表したマウス全脳透明化/3次元的イメージング技術「CUBIC」において開発した組織の「脱脂」効率の評価系となるin vitro(試験管内)スクリーニング手法注1)を参考に、組織透明化に求められるパラメータである「脱色」、「屈折率調整」、「脱灰」について、同様のスクリーニング手法を開発しました。そして、水溶性が期待される約1,600種類の化合物の水溶液を調整し、その手法でスクリーニングしました。それぞれの化合物は、特有の官能基、溶解度パラメータ、構造、幾何学的パラメータを含んでいます。スクリーニング結果に対して、20種類以上のケミカルパラメータをプロファイリングすることで、脱脂・脱色・屈折率調整・脱灰において重要な化学的性質が明らかになりました。

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